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先天性静止性夜盲大鼠视觉信号特征及其视觉信号传导通路重塑

作　者: 陶冶
导　师: 张作明; 薛军辉; 庞继景
学　校: 第四军医大学
专　业: 航空、航天与航海医学
关键词: 先天性静止性夜盲多电极阵列视觉信号通路重塑
分类号: R85
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

先天性静止性夜盲(congenital stationary night blindness, CSNB)是一种非进展性、以视杆视觉信号系统功能障碍为主的遗传性视网膜病。我们实验室发现的Cacna1f基因自然突变CSNB大鼠,其电生理及行为学证明其克服了基因工程诱导突变动物模式与临床实际差异较大的缺陷,因此可以作为研究CSNB发病机制及视网膜信号通路之间相互关系的一种有效模型。Cav1.4型钙通道为L-型钙通道的亚型之一,其主要的功能单位a1f亚基由Cacnalf基因编码。目前发现Cacna1f基因多种位点突变可损伤视杆和视锥信号传导通路,并与性染色体遗传的不完全型静止性夜盲密切相关。研究已证实Cacna1f基因突变导致的α1f亚基缺陷可使光感受器细胞带状突触数量、形态以及功能发生异常,从而引发光感受器细胞与二级神经元之间视觉信号传导障碍。近期形态学研究发现,自然突变CSNB大鼠视网膜双极细胞所发出的异常突触可伸及外核层外部,外丛状层厚度减少,水平细胞数目减少,而视网膜内层的超微结构则相对正常完整。上述视网膜外层发生的形态学变化很可能影响视网膜内层的视觉信号通路的传导整合功能。然而,CSNB动物视网膜外层所发生的形态学变化及神经递质释放功能障碍对视网膜最内层的神经节细胞会产生何种病理学效应,至今未见诸于报道。多电极阵列系统已广泛应用于视网膜神经元电生理活动记录等实验研究,由于其具备完整性、非侵入性的优点,因而此电生理实验技术弥补了传统的活体外记录与复杂的活体内记录的先天缺陷,目前已经被应用于记录监测光感受器细胞、神经节细胞等视网膜神经元的生理活动。本研究采用多电极阵列记录系统和先天性自然突变大鼠动物模型,根据其视网膜内层信号通路的视觉电生理信号所发生的特征性改变来证明其信号通路发生的重塑,并以此为基础阐明通路重塑的发生机制,为进一步制订治疗方案及采取针对性的视觉干预保护措施提供依据。材料与方法实验采用近交系CSNB大鼠(SPF级,F23,8-10周龄)及正常同龄对照Wt大鼠,将大鼠暗适应12-15小时,深度麻醉后处死大鼠摘取眼球,除去眼前节和视网膜色素上皮层,制备视网膜铺片,并将其神经节细胞面向下贴附于多电极阵列记录芯片,并使其适应生物记录芯片中的灌流环境。药理学实验环节中,实验中所涉及的药品经活性灌注系统进入灌流液。电脑刺激器控制的发光二级管所产生的白光经透镜系统汇聚形成光斑,投射到生物芯片灌流槽之中的视网膜铺片上,给予其同步全野光刺激。多电极阵列系统电极所采集到的神经元电信号经过放大器过滤并放大,存储于电脑系统供后续离线软件分析处理。单电极所采集的电生理信号进行放电分析时,其检测阈值设定为平均幅值的四倍标准差。然后应用Offline Sorter将备选放电波形进行处理,采取其前三个主要组成部分应用NeuroExplore软件进行后续分析：使用K-均值分解类聚算法识别集簇放电；分析单个记录单元的放电序列间距直方图来确定其放电的规则性及峰电位分布,并结合单个记录单元的围刺激时间柱形图来判断放电细胞的种类。电刺激实验环节中,位于阵列中央的28号电极所产生的双阶平衡电流刺激序列诱发视网膜神经元电生理反应,并为阵列中其它电极采集记录,应用相同软件进行分析处理。结果1.野生型SD大鼠与CSNB大鼠视网膜光刺激诱导场电位施加光刺激程序后,多电极阵列记录系统可从Wt大鼠视网膜铺片采集到典型的光诱发场电位波形,其a波峰值为0.196±0.038mv(n-20)。应用ON-型双极细胞mGluR6受体的特异性拮抗剂APB (100μM/L)不能阻断a-波却可阻断b-波。CSNB大鼠视网膜铺片记录中,光诱发场电位a-波峰值显著减小(0.078±0.026mv, n-20, P<0.01), b-波缺如。2.野生型SD大鼠与CSNB大鼠视网膜电刺激放电反应施加双阶平衡电流刺激后,在野生型大鼠和CSNB大鼠电刺激后原始波形中均可发现两种类型电刺激反应：短潜伏期反应和长潜伏期反应。按照神经节细胞与电流刺激电极的间距将其分为14组：(100μm组,141μm组,200μm组,223μm组,283μm组,300μm组,316μm组,361μm组,387μm组,400μm组,424pm组,447μm组,500μmm组和566μm组)。结果发现神经节细胞的电刺激反应强度随其与位于阵列中央的电流刺激电极间的距离增加而降低；在所分组中,CSNB大鼠视网膜的长潜伏期反应的放电数目均较野生型大鼠减少(P<0.01)。3.野生型SD大鼠与CSNB大鼠视网膜自发性放电反应多电极阵列记录系统从每个视网膜铺片中可同时记录到来自30个-90个神经节细胞的自发放电。分析发现CSNB大鼠视网膜神经节细胞的自发放电频率(9.93±4.14Hz,n=386)显著高于野生型大鼠(2.610.73Hz,n=295, P<0.01)。从累积自发放电频率曲线图可以观察到,CSNB大鼠视网膜神经节细胞的自发放电频率曲线较野生型大鼠斜率降低且发生右移。4.野生型SD大鼠与CSNB大鼠视网膜自发性放电神经节细胞的类型将产生自发性放电反应的神经节细胞归类为四种类型：爆发型放电细胞,常规型放电细胞,非常规型放电细胞,混合型放电细胞。CSNB大鼠视网膜爆发型放电细胞和混合型放电细胞占所有自发放电神经节细胞的比重高于野生型大鼠(Wt：爆发型15.2%,混合型：24.7%,n-20；CSNB:爆发型：24.3%,混合型：31.6%,n-20,P<0.01)而非常规型放电细胞占所有自发放电神经节细胞的比重低于野生型大鼠(Wt:51.4%, CSNB:36.8%; P<0.01)。 CSNB大鼠视网膜混合型放电神经节细胞的放电总数(246553个,n-20)显著高于Wt大鼠视网膜神经节细胞混合混合型放电细胞的放电总数(112089,n=20,P<0.01)。 CSNB大鼠和Wt大鼠视网膜其它三种神经节细胞的放电总数无显著差异(P>0.05)。5.野生型SD大鼠与CSNB大鼠视网膜光诱导放电反应按照对光反应的放电特征可将来自CSNB大鼠和Wt大鼠视网膜的神经节细胞分为六大类：1)给光型(ON-型)；2)撤光型(OFF-型)；3)给-撤光型(ON-OFF型)；4)持续给光型(sustained ON型)；5)持续给-撤光型(sustained ON-OFF型)；6)延迟撤光型(delayed OFF型)。CSNB大鼠视网膜神经节细胞光诱导放电反应的平均频率(16.40±9.97Hz,n-340)较野生型大鼠显著降低(38.6211.78Hz,n=373, P<0.01)。与Wt大鼠视网膜相比,CSNB大鼠视网膜的暗适应自发放电(背景噪声)频率较高而光诱导放电反应(视觉信号)频率较低,因此其信号/噪声比(S-N ration)减小。6.野生型SD大鼠与CSNB大鼠视网膜自发放电的互相关活动在野生型大鼠视网膜中,观察到三种特征性神经节细胞互相关活动类型：短时程互相关活动、中时程互相关活动和长时程互相关活动。而在CSNB大鼠视网膜记录数据中只观察到短时程互相关活动和中时程互相关活动,长时程互相关活动消缺失(n=20)。应用100uM18p-GA可明显降低CSNB大鼠视网膜神经节细胞的自发性放电频率,而其对野生型大鼠视网膜的放电频率无明显影响(n-5)。7. CSNB大鼠视网膜视觉信号传导通路的重塑按照单个神经节细胞ON-型放电反应频率占其光诱导放电反应总频率的比例,将其归为三类：1)ON反应主导型神经节细胞(比率>0.5)；2)OFF反应主导型神经节细胞(比率<0.5)；3)均衡反应型神经节细胞(比率=0.5)。较野生型大鼠,CSNB大鼠视网膜中的OFF反应主导型神经节细胞数占光诱导放电神经节细胞总数的比例增加(Wt:60.6%; CSNB:78.1%),而ON反应主导型神经节细胞数所占的比例减小(Wt:31.5%; CSNB:18.2%)。对照两种大鼠视网膜神经节细胞光诱导ON-型和OFF-型反应的潜伏期发现：CSNB大鼠的ON-型和OFF-型反应潜伏期均较野生型大鼠显著延长(P<0.05)。应用用CNQX+PDA可明显阻断CSNB大鼠和野生型大鼠视网膜光诱导OFF-型反应：在两种视网膜中,撤光型神经节细胞(OFF RGCs)和给光-撤光型神经节细胞(ON-OFF RGCs)的OFF反应均可被阻断剂消除,而延迟撤光型神经节细胞(delayed OFF RGCs)和持续给光-撤光型神经节细胞的OFF反应无显著变化。施加药物鸡尾酒后,在CSNB大鼠视网膜中,光诱导神经节细胞放电反应的平均频率降低而ON-型反应平均频率增加(P<0.01),且ON-型反应的潜伏期显著减小(P<0.05)；Wt大鼠视网膜中的光诱导神经节细胞放电反应的平均频率降低,但ON-型反应的平均频率和潜伏期无显著变化(P>0.05)。结论1.在视网膜光诱发反应场电位记录中,CSNB大鼠视网膜光诱发场电位仍可记录到a-波,尽管其峰值显著减小,说明CSNB大鼠光感受器细胞至少保存了部分活性和功能；其光诱发场电位波形中b-波缺失表明CSNB大鼠视网膜视觉信号传导在第一级神经元与第二级神经元之间发生严重障碍。2.在电刺激放电反应记录中,CSNB大鼠视网膜的长潜伏期反应的放电频率较野生型大鼠降低,表明Cacnalf基因突变后来源于视网膜外层的间接突触刺激驱动减少。3. CSNB大鼠视网膜神经节细胞自发放电的频率升高表明：虽然CSNB大鼠视网膜外层视觉信号传导发生障碍且光感受器细胞功能存在缺陷,但其视网膜内层的自发性电生理活动亢进。4. CSNB大鼠视网膜混合型放电细胞占所有自发放电神经节细胞的比重升高,且混合型放电细胞的放电总数显著增加,因此可以判定活跃的混合型放电细胞是CSNB大鼠视网膜自发性电生理活动亢进的主要原因。5.信号/噪声比下降表明CSNB大鼠视网膜分离有效视觉信号与背景噪声的反应能力降低,其神经节细胞处理编码视觉信号的有效度和可信度发生缺陷,且直接影响到视网膜视觉信号传通路的效率。6. CSNB大鼠视网膜记录数据中长时程互相关活动消缺失,可能是其视网膜L-型钙通道失功能导致化学递质释放障碍导致视网膜外层的多突触环路信息输入减少或消失所造成。隙连接在CSNB大鼠视网膜中神经元协同放电活动中发挥重要作用,且其表达水平或活性功能发生上调。7. CSNB大鼠视网膜光感受器细胞和ON-型双极细胞发生视觉信号传导障碍后,其下游的视觉信号传导通路确实发生了重塑：光诱导放电反应频率降低主要归因于其ON-型放电反应减弱,OFF通路在内层视网膜视觉信号传导中占据主导地位,而ON通路与神经节细胞之间发生了某种程度的分离和障碍。综上所述,CSNB大鼠视网膜外层神经递质释放障碍与内层视觉信号传导通路重塑之间联系紧密,明确其视觉信号传导通路重塑的机制和时机可为下一步制订视觉保护干预措施、改进完善治疗方案提供依据。

先天性静止性夜盲大鼠视觉信号特征及其视觉信号传导通路重塑

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