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间充质干细胞联合环孢霉素A对角膜移植排斥的作用研究

作　者: 贾喆
导　师: 赵少贞
学　校: 天津医科大学
专　业: 眼科学
关键词: 干细胞治疗 环孢霉素A 角膜移植排斥 免疫调控
分类号: R779.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


目的穿透性角膜移植术(penetrating keratoplasty, PKP)的术后免疫排斥反应是导致手术失败的最主要原因。间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)具有调节多种免疫细胞(包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞以及树突状细胞)增殖和功能的作用。在前期研究中我们发现MSCs可以延长角膜植片存活时间,在此基础上,本研究通过大鼠异体角膜移植排斥反应动物模型,观察不同时期尾静脉注射MSCs,以及MSCs联合不同浓度环孢霉素A (Cyclosporin A, CsA)对角膜抑制排斥反应发生和转归的干预情况,初步阐明MSCs的免疫调节机理,以及MSCs与CsA之间的联合作用,为临床治疗角膜移植排斥反应提供新的思路和可供选择的方法。方法1.原代培养Wistar大鼠MSCs,达90%融合时传代培养。用流式细胞仪检测培养细胞的表型,并做体外诱导分化实验,以备后续实验使用。2.制作大鼠角膜移植动物模型,随机分为12组。注：其中(A、B、C组为重复上一阶段实验组)A组：对照组,给予等量不含药物的PBS。B组：术前尾静脉注射MSCs组。C组：术后尾静脉注射MSCs组。D组：排斥发生时尾静脉注射MSCs组。E组：术后注射MSCs+肌注1mg/kg/天CsA。F组：术后注射等量PBS+肌注1mg/kg/天CsA。G组：术后注射MSCs+肌注2mg/kg/天CsA。H组：术后注射等量PBS+肌注2mg/kg/天CsA。1组：术后注射MSCs+肌注5mg/kg/天CsA。J组：术后注射等量PBS+肌注5mg/kg/天CsA。K组：术后注射MSCs+肌注10mg/kg/天CsA。L组：术后注射等量PBS+肌注10mg/kg/天CsA。裂隙灯下对角膜植片进行临床观察,以混浊、水肿和新生血管3项指标作为临床评估标准,比较各组角膜植片的平均存活时间。3.角膜移植模型建立后10天,收集A、C、G与H组大鼠脾脏以及腹股沟淋巴结,分离单个核细胞,在刀豆蛋白A(concanavalin A, ConA)刺激下孵育72h后,采用BrdU试剂盒检测各组大鼠免疫应答强度。4.取ConA剌激下A、C、G与H组大鼠脾脏和淋巴结单个核细胞孵育72h后的上清液,采用ELISA试剂盒检测Thl类和Th2类细胞因子分泌情况。5.角膜移植模型建立后10天,取A组和C组大鼠脾脏以及淋巴结,流式细胞仪测定CD4+CD25+Foxp3+T细胞占CD4+T细胞的百分比。结果1.成功分离并鉴定了MSCs, MSCs呈间质细胞特性：梭形,漩涡状排列。VonKossa染色、油红染色贴壁细胞呈骨样细胞及脂肪样细胞分化。2.成功建立大鼠角膜移植动物模型。3.采用MSCs单独治疗角膜移植术后大鼠,术后注射组角膜植片的存活时间与A组相比明显延长(P<0.05)。术前和排斥时治疗组与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。4.单独使用CsA治疗角膜移植术后大鼠,除F组,H、J和L组大鼠角膜植片存活时间均显著延长(P<0.05)。5.MSCs与2mg/kg的CsA联合治疗大鼠排斥模型时(G组),与单独使用MSCs或2mg/kgCsA相比(C和H组),植片存活时间延长。MSCs与5mg/kgCsA或10mg/kgCsA联合应用时,联合效果不显著(P>0.05)。而MSCs lmg/kgCsA联合应用时,MSCs对植片的保护作用被逆转(P<0.05)。6.T细胞增殖实验表明,MSCs和/或CsA均可以显著抑制T细胞增殖(P<0.05)。7. ELISA结果显示,C、G、H组Th1细胞因子分泌显著降低(P<0.05),而Th2细胞因子(IL-4)分泌升高(P<0.05)。与对照组(A组)相比,C组大鼠体内CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞比例显著增高(P<0.05)。结论MSCs可以通过抑制T细胞免疫应答、改变Th1/Th2应答平衡以及上调调节性T细胞,有效预防并治疗角膜移植免疫排斥反应。MSCs与CsA联合使用,其效果取决于CsA的浓度。

全文目录


中文摘要  4-6
Abstract  6-10
缩略语/符号说明  10-11
前言  11-13
  研究现状、成果  11-12
  研究目的、方法  12-13
1.1 实验动物与材料  13-15
  1.1.1 实验动物  13
  1.1.2 实验所用的主要仪器和设备  13-14
  1.1.3 主要试剂及溶液配制  14-15
1.2 方法  15-22
  1.2.1 MSCs原代培养  15
  1.2.2 MSCs传代、纯化和扩增  15
  1.2.3 MSCs的冻存与复苏  15-16
  1.2.4 MSCs的鉴定  16-17
  1.2.5 角膜移植动物模型制备  17-18
  1.2.6 动物模型的分组与治疗  18
  1.2.7 临床观察及评分  18-19
  1.2.8 淋巴细胞增值实验  19
  1.2.9 细胞因子测定  19-20
  1.2.10 流式细胞术测定CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞  20-21
  1.2.11 统计学处理  21-22
1.3 结果  22-29
  1.3.1 MSCs的培养与鉴定  22
  1.3.2 各组受体大鼠角膜植片的存活情况  22-23
  1.3.3 MSCs抑制角膜移植排斥反应的发生  23-24
  1.3.4 CsA抑制角膜植片排斥反应的发生  24
  1.3.5 MSCs与不同浓度CsA的联合作用  24-25
  1.3.6 MSCs和/或CsA抑制体外致病性T细胞增殖和体内T细胞应答  25-27
  1.3.7 MSCs和/或CsA调节Th细胞因子分泌水平  27-28
  1.3.8 MSCs上调调节性T细胞  28-29
1.4 讨论  29-35
  1.4.1 MSCs的培养与鉴定  29
  1.4.2 MSCs的免疫学特点  29
  1.4.3 MSCs的免疫抑制作用  29-30
  1.4.4 MSCs调节辅助性T细胞(helperTlymphocyte,Th)  30-31
  1.4.5 MSCs上调调节性T细胞(regulatory T cell,Treg/Tr)  31-32
  1.4.6 MSCs的给药途径  32-33
  1.4.7 MSCs输注时间  33
  1.4.8 MSCs的安全性  33-34
  1.4.9 MSCs和CsA的联合作用  34-35
1.5 小结  35-36
结论  36-37
参考文献  37-45
发表论文和参加科研情况说明  45-46
综述  46-59
  参考文献  53-59
致谢  59

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中图分类: > 医药、卫生 > 眼科学 > 眼外科手术学 > 角膜移植
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