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囊泡分子免疫病理学改变对鼻内镜术后鼻腔粘膜上皮预后转归影响的研究

作　者: 王军旗
导　师: 文忠
学　校: 南方医科大学
专　业: 耳鼻咽喉头颈外科
关键词: 囊泡鼻粘膜预后转归鼻内镜手术炎症因子
分类号: R765.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

目的鼻息肉手术后鼻粘膜预后转归是一个非常复杂的过程,涉及囊泡形成、多种炎症细胞、细胞因子及介质等的参与。尤其是囊泡的形成对鼻粘膜上皮化可以产生重要影响。目前对鼻内镜术后鼻腔粘膜囊泡的形成机制并不清楚,临床上是否常规要清除囊泡也存在争议。本研究采用病理形态学、透射电镜、免疫组化、细胞因子及术后不同方式处理囊泡,探讨鼻内镜术后鼻腔囊泡的分子免疫病理形态学改变对慢性鼻息肉患者鼻腔术后粘膜预后转归的影响,以期为临床鼻内镜术后鼻腔粘膜良性转归提供理论依据。方法1.病例及标本1.病例选自珠江医院耳鼻咽喉头颈外科2010-03至2011-08行鼻内镜手术,术后定期随访且粘膜有囊泡、肉芽组织增生的慢性鼻窦炎(双侧,伴鼻息肉)患者48例(96侧),其中男27例,女21例,年龄16岁到72岁,平均36.5岁。全部病例根据慢性鼻窦炎、鼻息肉诊断和治愈标准(2007EPOS标准)纳入。所有病例统一手术方式及术前术后用药情况(口服或静脉抗生素、糠酸莫米松喷鼻及鼻腔冲洗),均在鼻内镜下换药。术后换药以术后20周内作为研究期限。术中取下鼻甲组织(轻轻刮除)、鼻息肉组织、术后鼻腔不同时期的囊泡组织以及完成术腔上皮化后的中鼻道上皮组织。2.分组及观察方式2.1临床部分：以96侧术腔为研究对象,根据对囊泡处理方式的不同,将其分为囊泡刮除组和未刮除组,鼻内镜下观察比较两组术后鼻粘膜上皮化情况；同时在换药的过程中人为地把囊泡组织划分为轻度组(单侧术腔囊泡≤5个,且囊泡直径均≤5mm)及中重度组(单侧术腔囊泡>5个或囊泡≤5个而囊泡直径>5mm),观察囊泡的差异是否影响患者术腔的上皮化进程。2.2:实验室部分：随机从临床部分48侧刮除组抽取40侧术腔作为研究对象,分别在术中、术后1-3周、术后6-8周及术后11～14周等4个时段采集中鼻道及下鼻甲组织。其中中鼻道的组织为实验组,同期的下鼻甲组织为对照组。采用HE染色及透射电镜方法观察囊泡的病理形态学变化。运用免疫组织化学法探讨各个时期的组织中的转化生长因子β1(transforming growth factor β1, TGFβ1)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的表达变化。3标本的制备及观察3.1光镜标本标本用10%中性福尔马林固定,自动脱水,常规石蜡包埋,连续切片3张,片厚4μ m。分别进行HE染色。光镜下观察各黏膜纤毛细胞、杯状细胞、基底膜、黏膜间质、炎症细胞和黏液腺体的改变。3.2扫描电镜标本2.5%戊二醛-2%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液,固定4h以上；缓冲液漂洗3次,10min/次以上；1%锇酸-0.1mol/L磷酸缓冲液,固定1.5h；缓冲液漂洗3次,10min/次以上；50%、70%、80%、90%、100%乙醇脱水,10-15min/次；100%丙酮浸泡2次,10-15min/次；丙酮：包埋剂=1:1,浸透1h；丙酮：包埋剂=1：2,浸透3h；纯包埋剂浸透过夜；样品挑出放入包埋板中聚合；60℃约48h至硬化；切1-2μm的半薄片,对照定位后,60-80nnm超薄切片,捞于铜网上；饱和醋酸铀,枸橼酸铅染色；SEM观察纤毛数量、脱落、紊乱、黏液附着情况。3.3炎症因子VEGF及TGFβ1免疫组织化学染色VEGF及TGFβ1免疫组织化学采用SP法染色染色,操作步骤按照试剂盒说明书进行,以PBS替代一抗设立阴性对照,以已知的阳性组织片作为阳性对照。图像采集利用OLYMPUS BH-2型摄影生物显微镜,在40倍接物镜下,选取阳性细胞集中的视野,调整图像效果,使图像的背底光密度一致。结果判定,阳性细胞可见棕黄色颗粒定位于细胞质或细胞膜。并采用Image-Pro Plus6.0软件进行图像分析,测量免疫组化切片的阳性面积和积分光密度,通过阳性区域的平均光密度比较阳性表达的强弱。4统计处理所有计量资料数据以X±s表示均数和标准差,选用SPSS13.0统计软件包分析软件对数据行正态分布检验,术腔上皮化时间比较采用析因设计的方差分析,各组之间的比较采用独立样本t检验,方差不齐时采用Satterthwaite近似t检验；VEGF及TGFβ1免疫组织化学表达采用重复测量的方差分析。,同一取材的部位组织不同时间点的免疫组化表达分别采用单向方差分析。Levene方差齐性检验,如方差齐,多重比较采用Bonferroni法；如方差不齐,选择方差不齐的近似F检验Brown-Forsythe法,多重比较方差齐性采用Dunnett’s T3法。同一时间点不同部位的免疫组化表达采用独立样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。结果1.鼻内镜下囊泡形态学变化鼻内镜下囊泡呈淡黄或灰白色,半透明、质软、广基或带蒂囊性泡状组织,部分内容物为囊液,部分呈实质性,多位于是筛窦术腔、额窦引流口。随着术后清理过程的进展,多数囊泡的透明度下降,部分较大的囊泡清理后创面会再次生成新的囊泡,新生成囊泡体积常较前有所减小。囊泡表面的痂皮等分泌物也随着时间的推移慢慢减少。鼻内镜下囊泡与息肉组织不易区别。2.病理学结果2.1光镜下囊泡组织均为假复层纤毛柱状上皮,术后1-3周组的囊泡组织多数表现为上皮剥蚀,基膜不连续,细胞间隙宽,间质内大量红细胞、少量嗜酸性粒细胞浸润、固有层水肿,上皮层、上皮下层嗜酸性粒细胞浸润,上皮下可见小血管及腺体增生；6-8周组的囊泡组织多数上皮层完整连续,上皮层可见杯状细胞、嗜酸性粒细胞、纤毛柱状上皮增多；11～14周的囊泡组织上皮层连续性良好,上皮下间质细胞增多,腺体成熟,腺体导管内及血管周围可见嗜酸性粒细胞等浸润；研究还发现有2例囊泡组织可见嗜酸性粒细胞聚集的现象,大量的嗜酸性粒细胞等聚集在囊泡组织的上皮下层及细胞间质。2.2透射电镜下见囊泡上皮细胞有相对密集的纤毛组织,排列稍紊乱,其间可见微绒毛,大部分纤毛的横断面可见9+2型微管结构,有些中心微管为9+1或者缺如。而对照组鼻息肉组织透射电镜下可见上皮细胞间隙较大,纤毛稀疏、粗细不均、线粒体肿胀等。3分子免疫学结果显示3.1TGFβ1免疫组化结果显示中鼻道组织：鼻息肉组、术后1-3周组、术后6-8周组、11～14周组的囊泡组织的阳性表达区域的平均光密度分别是0.63±0.06、0.61±0.06、0.58±0.08、0.39±0.04；同期的下鼻甲组分别是0.34±0.05、0.35±0.06、0.34±0.05、0.35±0.05。细胞因子TGFβ1免疫组织化学表达的变化采用重复测量的方差分析。不同取材部位即中鼻道组织和下鼻甲组织中TGFβ1的表达差异有统计学意义,中鼻道区域的组织明显高于下鼻甲(F=1010.957,P=0.000)。；不同的取材时间即术中、术后1-3周、术后6-8周及术后11～14周组织中TGFβ1的表达差异有统计学意义(F=73.658,P=0.000)；组织采集时间和采集部位有显著交互效应,二者的变化趋势明显不同(F=68.958,P=0.000)。中鼻道各组的TGFβ1随时间一直呈下降趋势,差异有统计学意义(F=128.247；P=0.000)；对应的同期下鼻甲各组变化相对较为平缓,差异无统计学意义(F=0.236,P=0.871)。TGFβ1主要定位于黏膜下层及间质的炎性细胞胞膜及胞质,炎性细胞聚集的部位表达较强。3.2VEGF免疫组化结果显示中鼻道的组织即术中鼻息肉、术后1-3周组、术后6-8周组、11～14周组的囊泡组织的阳性表达区域的平均光密度分别是0.28±0.03、0.22±0.03、0.34±0.05、0.23±0.03,同期的下鼻甲组织分别是0.23±0.02、0.24±0.05、0.23±0.03、0.24±0.04；不同取材部位即中鼻道组织和下鼻甲组织中VEGF的表达差异有统计学意义(F=56.265,P=0.000)。不同的取材时间即术中、术后1-3周、术后6-8周及术后11～14周组织中VEGF的表达差异有统计学意义(F=43.565,P=0.000)。标本采集时间和采集部位有显著交互效应,二者的变化趋势明显不同(F=49.227,P=0.000)。中鼻道的VEGF至手术后一直呈下降趋势,至术后术后3周,然后上升,术后6周达到高峰,然后下降,差异有统计学意义(F=94.608；P=0.000)。对应的同期下鼻甲组织变化相对较为平缓,差异无统计学意义(F=0.909,P=0.440)；VEGF主要定位于血管内皮细胞、部分上皮细胞、部分腺体细胞以及极少数炎性细胞的胞质。4囊泡严重程度和处理囊泡方式对鼻术后鼻腔粘膜上皮化的影响结果4.1囊泡的轻重程度对患者的上皮化影响具有统计学意义(F=12.628,P=0.001)；术后及时刮除术腔的囊泡组织有利于加快术腔的上皮化进程(F=11.120,p=0.000)；上述两因素不存在的交互效应,即囊泡的严重程度及刮除与否对术腔黏膜的上皮化不相互影响(F=1.862,p=0.191)。4.2中重度囊泡的两组研究表明,处理组和对照组术腔粘膜上皮化的时间分别为11.3±2.25周、13.6±3.28周。处理组即刮除囊泡组织能使术腔粘膜更快上皮化,鼻腔粘膜上皮化的时间平均缩短约1.5周,差异有统计学意义(t=2.586,p=0.014)。4.3轻度组中两组比较,处理组和对照组术腔粘膜上皮化的时间分别为9.9±1.71周、11.1±2.09周,囊泡组织的刮除与否对术腔粘膜上皮化进程的影响差异无统计学意义(t=1.814,p=0.075)。结论1.本研究依囊泡数量及大小可以而且应该划分为轻度组(单侧术腔囊泡≤5个,且囊泡直径均≤5mm)及中重度组(单侧术腔囊泡>5个或囊泡≤5个而囊泡直径>5mm)。2.术后对中重度囊泡进行及时的清除有利于鼻腔粘膜的恢复愈合,对轻度的囊泡组织采取保留的态度,可以减少轻患者的换药次数。3.囊泡是鼻内镜术后有可能经历的阶段,其出现可能提示是鼻腔粘膜术后对炎症存在的反映,存在病理形态学改变及细胞因子(VEGF和TGFβ1)的动态表达；这些变化可以成为鼻内镜术后粘膜预后转归的监测指标之一。

全文目录

摘要  3-9
ABSTRACT  9-18
前言  18-23
第一部分慢性鼻-鼻窦炎鼻内镜术后鼻腔粘膜的形态学观察研究  23-37
  1. 材料与方法  23-26
  2. 结果  26-31
  3. 讨论  31-36
  4. 结论  36-37
第二部分慢性鼻-鼻窦炎鼻内镜术后鼻腔粘膜的分子免疫病理学实验研究  37-55
  1. 方法  37-40
  2. 结果  40-44
  3. 讨论  44-50
  4. 结论  50-51
  附图  51-55
参考文献  55-61
全文总结  61-62
鼻内镜术后随访调查表  62-63
常用中英文缩写对照表  63-64
硕士期间成果  64-65
致谢  65-67
统计学证明  67

囊泡分子免疫病理学改变对鼻内镜术后鼻腔粘膜上皮预后转归影响的研究

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