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清鼻方治疗鼻咽癌的实验研究

作　者: 钟洁希
导　师: 陈锐深
学　校: 广州中医药大学
专　业: 中西医结合临床
关键词: 鼻咽癌清鼻方 CNE细胞免疫力低下
分类号: R739.63
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

鼻咽癌是我国常见的恶性肿瘤之一,在头颈部肿瘤中占首位,发病率有明显的地区分布。我国及东南亚地区较多见,其中广东中西部发病率最高。近年来NPC发病率逐年攀升,因其具体发病机制尚不明确,联合化疗近期效果显著,但毒副反应严重,容易导致不同程度的后遗症,严重影响患者的生活质量及预后。近年来中医药治疗鼻咽癌的优势备受国内外关注,已有实验和临床资料表明,中医药在提高肿瘤病人生活质量,延长生存时间,降低肿瘤复发和转移等方面具有独特的优势。“清鼻方”是陈锐深教授临床治疗鼻咽癌的临床经验方,广泛用于晚期鼻咽癌的治疗及鼻咽癌放疗的辅助治疗,在临床使用多年,具有良好的临床疗效。本课题将探讨“清鼻方”对免疫力低下小鼠非特异性免疫功能的影响及通过体外实验探讨“清鼻方”对CNE细胞增殖的影响,旨在从不同层面、不同靶点探讨“清鼻方”对鼻咽癌的作用机理,为临床使用提供科学的依据。目的：在建立免疫力低下模型小鼠基础上,应用清鼻方干预模型小鼠,研究清鼻方在增强机体免疫力的作用机理；在己分离出的鼻咽癌细胞株(CNE细胞)及血清药理学的基础上,通过细胞生物学、分子生物学技术,探讨清鼻方对CNE细胞的抑制作用。方法：(1)清鼻方对环磷酰胺诱导所致免疫力低下小鼠非特异性免疫功能的影响取健康雌雄各半的BALB/c种小白鼠70只,按随机区组法分为5组：模型对照组、清鼻方高剂量组、清鼻方低剂量组、干扰素阳性药对照药组及正常对照组。除正常对照组外,其余各组皮下注射环磷酰胺,按80mg/kg体重给药,连续给药3d造模。正常对照组、模型对照组、清鼻方高剂量组、清鼻方低剂量组均采取每天灌胃给药,干扰素组则采用隔天肌注给药,试验周期均为30天。以小鼠体重、脾脏称重、脾脏悬液细胞计数、血清IgA、IgG、IgM含量、T细胞亚群CD3/4/8表达水平进行评价。(2)清鼻方治疗效应对大鼠鼻咽上皮细胞增殖的影响研究制备中药复方清鼻方浓缩煎液。取健康雌雄各半SD大鼠12只,随机分为模型组6只和实验组6只。模型组采用生理盐水灌胃,而实验组采用中药清鼻方浓缩煎液灌胃,处理时长为5天。在大鼠腹主动脉取血,离心取上清制成含药血清直接作用于CNE细胞,并采用MTT法、流式细胞术,电子显微镜观察细胞生长曲线来研究清鼻方分别作用于CNE细胞后对肿瘤细胞生长的抑制情况,以及清鼻方诱导肿瘤细胞发生凋亡的情况。结果：(1)与空白组比较,各组小鼠体重、脾质量、脾脏指数、脾细胞总数均明显下降(P<0.01),其中模型组各数值均最低。骨髓有核细胞数各组与空白组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。模型组IgA水平明显降低,干扰素组、低剂量组和高剂量组IgA水平明显升高(P<0.01); IgG水平方面,模型组、干扰素组均明显降低(P<0.01),清鼻方低剂量组和高剂量组变化均不明显(P>0.05)；模型组、干扰素组、低剂量组IgM水平均升高,高剂量组反而降低,但均无统计学差异(P<0.05)。(2)与模型组比较,各用药组骨髓有核细胞数变化不明显(P>0.05)。低剂量组在体重、脾质量、脾脏指数、脾细胞总数方面与之比较,两者均无统计学意义(P>0.05)；高剂量组在小鼠体重、脾质量、脾脏指数方面明显高于模型组(P<0.01)；干扰素组体重、脾质量方面与模型组对比,差异均明显具有统计学意义(P<0.01)。干扰素组、低剂量组和高剂量组IgA水平均明显升高(P<0.01)；干扰素组IgG变化不明显,清鼻方低剂量组和高剂量组IgG水平俊明显升高(P<0.05)；干扰素组和低剂量组均无统计学差异(P<0.05),高剂量组明显低于模型组,两者相比差异有统计学意义(P<0.05)。(3)小鼠外周血CD3、CD4、CD8的整体表达水平相对脾脏较低。小鼠造模后外周血CD3、 CD4、CD8表达水平无明显下降,而脾脏CD3、CD4、CD8表达水平则明显下降；给予干扰素和清鼻方低高剂量后CD3、CD4、CD8表达水平均有一定程度的提升,其中干扰素组接近正常组水平,清鼻方低、高剂量组则均未达到正常组水平。(4)MTT法比色结果显示,在作用24h后,不同浓度清鼻方含药血清对CNE细胞的抑制作用不明显。作用48h后,血清浓度5%、10%、15%对CNE细胞的抑制作用明显；作用72h后,血清浓度5%、10%、对CNE细胞的抑制作用明显。(5)CNE细胞的增殖曲线结果显示：未灭活的正常大鼠血清或含药血清(10%和15%)均具有具有抑制细胞增殖的效果。其中15%未灭活含药血清较10%未灭活含药血清具有更强的抑制CNE细胞增殖的作用。灭活的正常大鼠血清或含药血清(10%和15%)也出现类似的情况,但整体效应低于未灭活血清组。(6)细胞凋亡率方面,用10%含药血清和正常大鼠血清处理CNE细胞后,正常大鼠血清出现凋亡细胞(23%),含药血清出现更高的凋亡率31.0%；用15%含药血清和正常大鼠血清处理CNE细胞后,正常大鼠血清也出现凋亡细胞(25.3%),而15%含药血清凋亡率达33.9%。结论：清鼻方能减轻化疗药物所致的免疫抑制状态,调节机体的细胞免疫与体液免疫,使紊乱免疫机能趋于正常,这将于鼻咽癌患者恢复；清鼻方含药血清能抑制CNE细胞的增殖,诱导细胞凋亡,这可能是其重要作用机理。

清鼻方治疗鼻咽癌的实验研究

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