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肠炎沙门氏菌毒力蛋白与宿主细胞蛋白相互作用的筛选和功能研究

作　者: 夏川
导　师: 刘奋勇
学　校: 武汉大学
专　业: 微生物学
关键词: 肠炎沙门氏菌 Ⅲ型分泌系统(T3SS) 毒力岛(pathogenicity islands) 蛋白组学 E3泛素连接酶 蛋白的泛素化修饰
分类号: R378
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


肠炎沙门氏菌(Salmonella enterica)是一种典型的革兰氏阴性致病菌。该菌主要引起畜禽的胃肠炎以及人类肠炎和食物中毒,严重威胁着人畜健康。肠炎沙门氏菌表达两个Ⅲ型分泌系统(type Ⅲ secretion systems,T3SS),由毒力岛1和毒力岛2(pathogenicity islands1and2, SPI-1and SPI-2)分别编码。细菌依赖T3SS将毒力蛋白运输至宿主细胞内发挥作用。通常认为,毒力岛1编码的毒力蛋白在细菌入侵的过程中起到作用,而毒力岛2编码的蛋白则负责促进细菌在细胞中的生存,复制以及免疫逃逸等的调节。目前已经鉴定出了30几个T3SS毒力蛋白,但是它们中的绝大多数其生理功能尚未知晓或了解很少。为探讨T3SS两个毒力岛的分泌蛋白的潜在生物学功能,并分析它们是怎样帮助细菌从入侵上皮细胞到在细胞内生存、复制的,鉴定这些毒力蛋白与宿主细胞蛋白的相互作用关系成为了必不可少的途径。本文从以下两个方面对T3SS分泌的毒力蛋白与宿主细胞蛋白的相互作用进行了系统分析,分别是：1.通过酵母双杂交技术严格系统地筛选20个T3SS毒力蛋白(SsPH2, Ssel、 SpiC、SseF、SseG、SlrP、SseJ、SopD2、SifB、SipC、SipB、SipA、SopD、SipD、 SptP、SopA、SopE2、SrfB、SrfA、SrfJ)与宿主细胞的相互作用蛋白,并最终得到了超过300对的阳性相互作用结果。我们对其中部分结果进行了免疫共沉淀验证并通过文献进行了初步的功能分类分析,并从蛋白质组学的角度构建了相互作用网络草图。这些蛋白功能分布广泛,涵盖了能量代谢、细胞骨架和细胞运动、物质运输以及细胞内多种信号通路的调节。结合文献,我们获得的大量数据为揭示细菌侵染细胞及之后的生物学功能和细菌对宿主细胞各种生物学通路系统的影响提供了理论基础和事实依据。2.选取SPI-2的重要毒力蛋白SsPH2为研究对象,探讨其对宿主内源泛素通路的影响作用。SsPH2作为一个最近才知晓的细菌编码的E3泛素连接酶,通过影响宿主内源泛素通路来促进细菌在宿主内的生存、复制以及调节宿主免疫反应。我们系统地鉴定了酵母双杂交得到的SsPH2作用对象,并着重研究了SsPH2与细胞蛋白LM04的相互作用。我们首先分别用不同方式验证了二者于体内、体外的相互作用,并探讨了其作用区域。接着我们通过体内、体外实验证实了SsPH2可以催化LM04蛋白的泛素化修饰。后面的进一步研究阐释了SsPH2对LM04的表达调控作用,我们发现SsPH2在体内稳定表达具有提高LM04蛋白水平的作用,通过深入研究这种调控的分子机制,我们发现SsPH2增强LM04蛋白水平是通过其对LM04的泛素化修饰来实现的。SsPH2抑制了LM04在细胞中的降解途径,从而延长了LM04蛋臼的半衰期。考虑到LM04与白细胞介素6(IL-6)途径的重要关系,我们猜测这种依赖于细菌SsPH2的LM04蛋白水平调节作用很可能影响了宿主IL-6信号通路,并调节了由IL-6介导的Stat3转录活性,从而影响宿主的早期炎症反应。以上发现揭示了SsPH2作为细菌编码的E3泛素连接酶通过特异性识别并泛素化修饰宿主蛋白LM04来实现细菌对宿主细胞生理功能的调节作用。综上所述,通过本课题的研究我们鉴定出了数量庞大的肠炎沙门氏菌T3SS毒力蛋白在宿主细胞中的相互作用对象,为后续的进一步功能分析打下了坚实的理论基础。此外我们着重研究了毒力蛋白SsPH2与宿主蛋白LM04的相互作用机制,并发现了SsPH2对LM04的泛素化修饰以及调节作用。我们的研究工作为肠炎沙门氏菌乃至整个革兰氏阴性菌界毒力蛋白与宿主蛋白相互关系的思考提供很多新的研究思路和方向。

全文目录


中文摘要  7-9
Abstract  9-14
第一章 引言  14-26
  1.1 肠炎沙门氏菌(Salmonella enterica)  14-17
    1.1.1 肠炎沙门氏菌概述  14-15
    1.1.2 毒力岛、毒力蛋白和Ⅲ型分泌系统(SPIs、Effectors and T3SS)  15-17
    1.1.3 宿主细胞对沙门氏菌感染的抵抗机制  17
  1.2 蛋白质的泛素化修饰途径(Ubiquitination)  17-21
    1.2.1 蛋白泛素化修饰过程简介  17-20
    1.2.2 细菌侵染宿主与泛素化修饰过程  20-21
  1.3 酵母双杂交技术(Yeast Two-Hybrid)  21-24
    1.3.1 酵母双杂交技术的原理  21-23
    1.3.2 酵母双杂交技术的应用：文库筛选(寻找相互作用蛋白对象)  23-24
  1.4 验证蛋白之间相互作用的常用方法  24-26
    1.4.1 Pull-down assay  24
    1.4.2 激光共聚焦(Confocal)  24
    1.4.3 免疫共沉淀(Co-Immnoprecipitation,Co-IP)  24-25
    1.4.4 其他：生物传感器、非变性胶、质谱等  25-26
第二章 实验材料与方法  26-43
  2.1 实验通用仪器、设备  26
  2.2 通用实验试剂  26-27
  2.3 常规分子克隆实验技术  27-30
    2.3.1 大肠杆菌化转感受态细胞制备和使用  27-28
    2.3.2 大肠杆菌电转感受态制备和使用  28
    2.3.3 大肠杆菌质粒的抽提  28-29
    2.3.4 PCR和限制性酶切  29
    2.3.5 定点突变PCR  29-30
  2.4 酵母双杂交系列实验  30-35
    2.4.1 cDNA文库的滴定和扩增  30-32
    2.4.2 酵母双杂交所用培养基  32
    2.4.3 酵母感受态的制备以酵母转化  32-33
    2.4.4 抽提酵母质粒  33
    2.4.5 X-gal显色实验  33-34
    2.4.6 酵母双杂交筛选文库  34-35
  2.5 细胞水平实验  35-37
    2.5.1 细胞培养基及试剂  35-36
    2.5.2 细胞培养(以293T细胞为例)  36
    2.5.3 磷酸钙法转染细胞(以转染6cm培养皿293T细胞为例)  36-37
    2.5.4 脂质体法转染细胞(以NEO fectine转染6cm皿293T细胞为例)  37
  2.6 体外蛋白质学实验  37-43
    2.6.1 PAGE电泳和Western Blot检测  37-40
    2.6.2 蛋白的原核表达及纯化  40-41
    2.6.3 免疫共沉淀实验  41
    2.6.4 GST pull-down实验  41
    2.6.5 体内及体外泛索化修饰检测实验  41-43
第三章 系统筛选与肠炎沙门氏菌T3SS毒力岛1、毒力岛2分泌蛋白相互作用的宿主蛋白  43-80
  3.1 综述  43-44
  3.2 实验过程和结果  44-73
    3.2.1 酵母双杂交以及真核表达诱饵(Bait)质粒的构建  44-45
    3.2.2 Bait质粒的酵母转化、鉴定及自激活实验  45
    3.2.3 cDNA文库的扩增及滴度测定  45-46
    3.2.4 文库筛选及阳性克隆的X-gal显色实验  46-47
    3.2.5 阳性克隆中酵母质粒的提取和分离  47-48
    3.2.6 阳性结果的酵母回交实验  48
    3.2.7 数据整理分析  48-72
    3.2.8 部分结果的免疫共沉淀验证  72-73
  3.3 分析与讨论  73-80
第四章 肠炎沙门氏菌T3SS毒力蛋白SSPH2特异性结合并泛素化修饰宿主蛋白LOM4  80-112
  4.1 综述  80-85
    4.1.1 肠炎沙门氏菌T3SS毒力蛋白SsPH2  80-81
    4.1.2 沙门氏菌毒力蛋白与泛素化修饰  81-82
    4.1.3 LMO4蛋白(LIM domain only4)  82-83
    4.1.4 实验概述  83-85
  4.2 实验过程与结果  85-107
    4.2.1 所用质粒的构建  85-88
    4.2.2 酵母双杂交验证相互作用  88-89
    4.2.3 免疫共沉淀验证LMO4与SsPH2的体内相互作用  89-90
    4.2.4 GST-pull down  90-92
    4.2.5 SsPH2与LMO4结合域的确定  92-95
    4.2.6 SsPH2泛素连接酶活性的体外检测  95-96
    4.2.7 SsPH2于体内和体外均可催化LMO4的泛素化修饰  96-100
    4.2.8 SsPH2催化LMO4泛素化修饰既不是泛素分子K48也不是K63依赖的  100-102
    4.2.9 SsPH2催化LMO4第29位和67位赖氨酸残基(K29,K67)泛素化修饰  102-103
    4.2.10 哺乳动物细胞中SsPH2的表达上调LMO4的蛋白水平  103-105
    4.2.11 SsPH2对LMO4蛋白水平的上调是通过延长LMO4蛋白的半衰期实现的,并且这种作用依赖于SsPH2对LMO4的泛素化修饰  105-107
  4.3 分析与讨论  107-112
参考文献  112-120
攻博期间已发表或正在撰写的论文  120-121
致谢  121-122
附录  122-123

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学微生物学（病原细菌学、病原微生物学） > 病原细菌
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