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林生地霉致消化道感染的动物实验研究

作　者: 李俊捧
导　师: 朱敬先; 高顺强
学　校: 河北医科大学
专　业: 皮肤病与性病学
关键词: 林生地霉免疫状态给药途径
分类号: R756
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的：林生地霉（Geotrichum silvicola）是2002年从巴西果蝇和印度柞蚕幼虫身上分离出的一种罕见地霉属真菌，随后我科也相继从一例脓癣患儿皮损中和一例中毒性表皮坏死松解症患者的血液中分离得到该菌，在此之前未有林生地霉感染人类[1,2]的报道。尹瑞瑞等人通过建立林生地霉致动物系统性感染模型，证实了该菌在一定条件下可引起肝、肾、脾、肺、心等深部脏器的病变，并通过计算载菌量对各脏器的感染情况进行了比较。本实验通过不同给药途径予不同免疫状态小鼠注射林生地霉菌悬液，实验结束后取小鼠胃、肠道做组织逆培养，检测其是否能引起胃肠道的感染，并通过计算内脏组织载菌量，比较不同免疫状态、不同给药途径下小鼠胃肠道真菌感染的情况，该实验将进一步丰富林生地霉致小鼠系统性感染的研究。方法：1林生地霉引起小鼠系统性感染模型的建立将本科真菌室保存的林生地霉菌株经常温下复苏转种，制成菌悬液后注入小鼠体内，使其恢复其活性和毒力，再将分离后的活化菌株用无菌生理盐水制成一定浓度的菌悬液通过皮下、腹腔、静脉三种途径给予小鼠进行注射。2小鼠临床症状及死亡情况的观察分别对观察组免疫抑制状态、非免疫抑制状态每种给药途径小鼠的饮食、饮水、反应、活动、毛发变化及精神状况等进行观察，并记录14天内各组小鼠的死亡情况。与正常对照组小鼠进行比较，观察各实验组小鼠粪便的次数、形态等的变化情况。3消化道脏器形态学观察将死亡小鼠于无菌条件下取其胃、小肠、大肠，生理盐水冲洗消化道食物残渣，观察脏器大体形态的变化。4组织真菌逆培养将小鼠胃、小肠、大肠分离后用组织研磨器研碎，挑取少量内脏组织三点接种于沙氏试管培养基的表面，后置于37℃温箱中培养1周，观察真菌的生长情况。培养阳性的菌落做酚棉兰染色，镜下观察菌丝及孢子形态。5组织病理学观察将死亡小鼠进行解剖，取肉眼病变较明显的部分脏器先用10℅甲醛液固定，再经脱水，透明，浸蜡，包埋，切片，展片后，分别进行HE（苏木素-伊红）染色和PAS（过碘酸-锡夫）染色。6胃、肠组织载菌量的测定在无菌条件下将称重后的胃、小肠、大肠用组织研磨器研碎后，按照1:10（wt/vol）加入无菌生理盐水混匀，从中吸取10ul组织悬液均匀的平铺在沙氏平皿培养基表面，于37℃温箱中培养48小时后读取培养基表面的菌落数，计算各组织中载菌量。结果：1临床症状免疫正常静脉组和腹腔组各小鼠接种林生地霉后期饮食、饮水稍减少，余无明显改变。免疫抑制静脉组和腹腔组小鼠接种林生地霉后早期即出现饮食、饮水减少，毛发倒逆无光，精神状态萎靡，体重持续下降。免疫正常与免疫抑制皮下组小鼠背部于注射部位出现一绿豆至花生豆大小，质稍硬的结节，后者较前者结节较大，表面有破溃。2死亡情况免疫抑制静脉组小鼠在接种后第1天出现死亡，第7天达到死亡高峰，9天内死亡率为100%；免疫抑制腹腔组小鼠在接种菌液后第4天出现死亡，第8天达到死亡高峰，12天内死亡率为100%。其余各组小鼠未出现死亡情况。3组织大体形态变化免疫抑制腹腔组和静脉组小鼠胃、小肠、大肠表面组织发红、质脆，未见明显化脓灶，内可见极少量内容物；免疫抑制皮下组和免疫正常各组小鼠上述脏器肉眼观无明显变化。4组织逆培养免疫抑制与免疫正常腹腔组和静脉组小鼠胃、小肠、大肠组织逆培养3天左右即可见培养管内有菌落生长，且其镜下菌丝形态与接种的菌株相同。5组织病理变化HE染色可见组织细胞出现变性、坏死，周围有部分炎细胞浸润；PAS染色可以见到组织内紫红色的菌丝和部分关节状或圆形的孢子。6真菌载菌量的测定免疫抑制静脉组和腹腔组小鼠胃肠组织载菌量均分别高于免疫正常静脉组和腹腔组小鼠胃肠组织，其中静脉组载菌量均高于腹腔组。胃组织载菌量高于肠道组织载菌量，小肠与大肠载菌量无明显差异。结论：1腹腔注射、静脉注射途径均可引起小鼠胃、小肠、大肠感染，两者比较，静脉注射途径引起的感染较腹腔注射途径严重。皮下注射途径不能引起小鼠胃、小肠、大肠感染。2免疫抑制状态较免疫正常状态小鼠更易引起胃、小肠、大肠的感染，也引起更高的死亡率，说明林生地霉致病力与机体免疫状态相关，是一种条件致病菌。3无论何种免疫状态、何种给药途径，胃均较肠道更易引起感染，大肠与小肠的感染情况无明显差别。4小鼠胃、肠林生地霉感染病理切片显示：组织呈炎症性改变

林生地霉致消化道感染的动物实验研究

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