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新的丙型肝炎病毒细胞培养模型建立的研究

作　者: 高艺
导　师: 龚环宇
学　校: 中南大学
专　业: 传染病学
关键词: 丙型肝炎病毒(HCV) 细胞培养模型真核表达质粒 HEK-293T细胞
分类号: R-332
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

目的：构建一种新的含有HCV全长基因以及荧光素酶基因的真核表达质粒及其复制缺陷质粒,直接转染HEK-293T细胞,通过荧光素酶检测HCV RNA在细胞内是否有表达并在一定程度上对HCVRNA水平定量,建立一种新的实用方便的HCV细胞培养研究模型。方法：1.用基因克隆方法,在HCV全长基因复制子质粒中插入萤火虫荧光素酶基因片段LUC,体外构建含萤火虫荧光素酶基因和HCV全长基因的双顺反子重组HCV复制子真核表达质粒,在此质粒基础上切除包含HCV NS5B端RNA多聚酶活性位点在内的18个核苷酸,构建复制缺陷型重组质粒,经限制性内切酶酶切分析和测序分析重组质粒以及相应的复制缺陷重组质粒构建是否正确。2.重组质粒以及相应的复制缺陷重组质粒采用磷酸钙法转染HEK-293T细胞。3.发光检测仪检测转染后HEK-293T细胞内萤火虫荧光素酶数值4.分别以HCV正负链引物行RT-PCR半定量检测转染后HEK-293T细胞中HCV RNA的表达和复制5.荧光定量PCR检测转染后细胞培养基中HCV RNA的量。结果：1.质粒酶切和测序证明正确构建了重组真核表达质粒和相应的复制缺陷重组质粒。2.转染重组真核表达质粒组细胞以HCV正、负链引物行RT-PCR,均能扩增出目的条带,表明重组真核表达质粒能在HEK-293T细胞中正确转录HCV RNA并进行有效复制,细胞培养基HCV RNA水平高达108IU/ml。3.转染复制缺陷重组质粒组细胞仅正链引物扩增出明显条带,负链引物不能扩增出目的条带,显示复制缺陷重组质粒能在HEK-293T细胞中正确转录HCV RNA但不能有效复制,细胞培养基中HCV RNA水平小于500IU/ml。结论：成功构建了重组真核表达质粒和相应的复制缺陷重组质粒并证实其能在HEK-293T细胞表达,为在HCV细胞培养模型中进一步研究HCV的致病机制和筛选抗HCV药物提供了有效技术平台。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-8
目录  8-9
前言  9-13
第一章材料与方法  13-35
  1.1 实验材料  13-15
    1.1.1 实验所使用的菌株、质粒和细胞株  13
    1.1.2 主要试剂及来源  13-14
    1.1.3 实验所需主要仪器设备  14-15
  1.2 实验技术路线  15-16
    1.2.1 重组质粒以及复制缺陷重组质粒的构建  15-16
    1.2.2 重组质粒以及复制缺陷重组质粒在HEK-293T细胞中的表达  16
  1.3 实验方法  16-35
    1.3.1 pSL304和pSL305质粒的提取  16-18
    1.3.2 重组质粒的构建  18-23
    1.3.3 复制缺陷型重组质粒构建  23-28
    1.3.4 细胞培养  28
    1.3.5 细胞转染  28-29
    1.3.6 萤火虫荧光素酶测定  29
    1.3.7 半定量RT-PCR检测HCV RNA的表达  29-32
    1.3.8 荧光定量PCR检测细胞培养液中HCV RNA量  32-34
    1.3.9 统计学分析  34-35
第二章结果  35-43
  2.1 pSL307质粒结构及质粒构建  35-37
  2.2 质粒pSL308的构建  37-39
  2.3 转染细胞中荧光素酶的表达  39-40
  2.4 HCV RNA在转染细胞中的表达和复制  40-41
  2.5 荧光定量PCR测定细胞培养基中HCV RNA量  41-43
第三章讨论  43-48
  3.1 HCV的研究模型  43-45
  3.2 含萤火虫荧光素酶基因的复制子的构建  45-48
第四章结论  48-49
参考文献  49-53
综述  53-64
  参考文献  60-64
致谢  64-65
攻读学位期间的主要成果  65

新的丙型肝炎病毒细胞培养模型建立的研究

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