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高乌甲素抗痛觉过敏机制研究及羟考酮伍用高乌甲素药效学研究初探

作　者: 张嘉宝
导　师: 张硕峰
学　校: 北京中医药大学
专　业: 中药药理学
关键词: 高乌甲素痛觉过敏羟考酮伤害感受阈值
分类号: R285.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

痛觉过敏指在伤害性刺激下受损部位以及周围组织或远处可产生各种敏感性增强的疼痛或在痛觉过敏区域引起的更加强烈的疼痛。外周组织炎症或神经损伤常常引起痛觉过敏(hyperalgesia).其产生是外周和中枢敏感化的结果,而脊髓敏感化起着十分重要的作用。近年研究表明,脊髓背角拥有许多控制疼痛信息传递的重要因子。其中星形胶质细胞与小胶质细胞,在病理性疼痛的产生和维持过程中发挥了重要作用,激活的胶质细胞不仅可以释放兴奋痛觉反应神经元的物质,同时还可以释放促炎性细胞因子使机体产生痛觉过敏；c-fos基因的激活可以作为疼痛神经元兴奋的标志并可以改变脊髓中强啡肽等肽类水平,从而使细胞的功能发生长时相的变化,表明其在痛觉过敏形成的中枢机制中发挥了一定作用；兼具信使与效应分子双重身份的NO被发现在热痛觉过敏中起着关键性作用,伤害性刺激导致的脊髓内神经元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase, nNOS)增加可使NO表达增多从而诱发痛觉过敏的产生,同时nNOS被认为是NO表达的脊髓标志物。P2X3受体是背根神经节(dorsal root ganglion, DRG)上分布的P2X受体之一,其可以高度选择表达在与伤害性感受有关的中、小径DRG神经元上,在伤害性刺激下增加的三磷酸腺苷(adenosine5’-triphosphate, ATP)可以诱发P2X3受体的表达,从而导致初级传入神经元的过度兴奋。高乌甲素(lappaconitine, LA)是从毛茛科植物高乌头根部提取分离的二萜生物碱,是我国首创的非成瘾性镇痛药物,并被列为癌症患者三阶梯镇痛用药,在临床应用中具有无成瘾性、无致畸胎、无致突变、无积蓄中毒和不良反应少的优点。在既往的研究中,研究者们对高乌甲素的作用部位的认识主要集中在脊髓以上中枢,同时更有研究进一步表明高乌甲素是Na+通道和Ca2+通道的阻断剂,对K+电流有整合作用,并涉及了中枢去甲肾上腺系统、阿片系统和下行调制系统。而近年来高乌甲素在临床中被广泛应用于硬膜外麻醉、蛛网膜下腔阻滞等,效果良好。因此推测高乌甲素亦存在脊髓或脊髓下水平镇痛机制。本研究通过拟建慢性炎性疼痛大鼠模型,观察高乌甲素对慢性炎性大鼠机械伤害感受阈值的影响,以及对脊髓星形胶质细胞、小胶质细胞、c-fos、NOS和P2X3受体表达的影响,探讨高乌甲素抗痛觉过敏作用及其机制,并以此判断其在脊髓水平的作用机制。同时根据临床中高乌甲素与吗啡联合应用于硬膜外麻醉的良好效果以及羟考酮与吗啡的相似性,将高乌甲素与羟考酮进行配伍,通过考察复方药物对机械刺激和热刺激的作用效果,初步探究两者伍用的镇痛效果。第一部分慢性炎性疼痛大鼠模型的建立1CFA足底皮下注射对大鼠形态学改变及机械伤害感受阈值的影响目的：通过观察大鼠足底皮下注射完全弗氏佐剂后,外观一般状态改变以及机械伤害感受阈值的变化趋势,判断CFA大鼠的慢性炎性疼痛模型是否成立。方法：在制模大鼠的左后足足底皮下注射CFA100μl,用机械伤害感受测试器在动物制模前、制模后第1天、第3天、第6天、第9天、第11天和第13天测量大鼠伤害感受阈值；观察大鼠在建模后注射足外观形态和步态的变化。结果：建模大鼠造模后状况良好,探索和直立等自主活动减少,注射足持续红肿,并在静息状态下注射足呈现肢体保护状态；注射足在机械伤害感受测量时,肌肉收缩有力无肢体偏瘫,没有自噬肢体现象出现；模型大鼠的伤害感受阈值在建模之后明显下降,并在制模第6天出现疼痛峰值,整个实验过程中疼痛现象没有缓解。结论：足底皮下注射CFA可以造成大鼠慢性炎症疼痛模型,在13天内都可以维持稳定的炎性疼痛及其症状；可以满足研究对于慢性炎性疼痛模型的稳定性和时间要求；推测模型大鼠在建模第6-13天有痛觉过敏产生。2CFA足底皮下注射对大鼠脊髓胶质细胞、c-fos及NOS表达的影响目的：通过观察足底皮下注射完全弗氏佐剂13天后大鼠脊髓注射侧胶质细胞、c-fos以及NOS的表达情况判断该模型是否存在大鼠的炎性痛觉过敏。方法：在建模14天时将大鼠进行灌注,取出脊髓L4-6节段,应用免疫组织化学的方法进行检测脊髓背角中GFAP, OX-42(CD11b/c). c-fos和NOS表达情况,并将注射侧和对侧脊髓背角中的指标进行对比。结果：注射侧脊髓背角中的胶质细胞、c-fos和NOS都显著表达,各指标的阳性显色的平均光密度(AOD)与对照组、模型动物注射对侧脊髓背角的阳性显色AOD之间均存在显著地统计学差异。结论：足底注射CFA的大鼠模型可以产生痛觉过敏,并且模型动物没有继发性炎症疼痛出现。第二部分高乌甲素抗痛觉过敏机制研究1高乌甲素对大鼠慢性炎性疼痛的影响目的：研究高乌甲素对于形成痛觉过敏的CFA致炎大鼠的机械伤害感受痛阈值的抑制作用。方法：采用足底皮下注射CFA100pni的大鼠慢性炎性疼痛模型,在制模前和制模第6天、第9天、第12天、第13天测定大鼠机械伤害感受阂值；在建模第7天开始灌胃给药,每天一次,连续给药6天；第9天及第12天测试均在动物给药1h后测量动物机械伤害感受值,第13天在末次给药18h后测量机械伤害感受值。结果：高乌甲素16mg/kg可以提高模型大鼠的机械伤害感受阈值,与模型组之间存在具有统计学意义的差异；高乌甲素8mg/kg对于模型大鼠的机械伤害感受阈值几乎没有作用；停药18h后,高乌甲素16mg/kg、8mg/kg可以使模型动物的平均机械伤害感受阈值高于模型组。结论：高乌甲素16mg/kg可以对大鼠的慢性炎性疼痛产生抑制作用,但镇痛强度不及羟考酮3.5mg/kg；高乌甲素给药组模型动物停药18h后机械伤害感受阈值均值依然高于模型组,推测高乌甲素具有抑制痛觉过敏产生指标机制的作用。2高乌甲素对CFA大鼠脊髓GFAP、OX-42(CD11b/c)、c-fos、NOS和P2X3的影响目的：研究高乌甲素对CFA大鼠脊髓胶质细胞、c-fos、NOS及DRG中P2X3表达的抑制作用。方法：末次机械伤害感受阈值测量结束后,大鼠进行灌注取材,取出脊髓L4-6节段以及注射侧的L4-6背根神经节,应用免疫组织化学方法检测注射侧脊髓背角GFAP. OX-42(CD11b/c). c-fos. NOS和DRG中P2X3的表达情况。结果：高乌甲素16mg/kg有效降低注射侧脊髓背角GFAP. OX-42(CD11b/c). c-fos.NOS及DRG中的P2X3的阳性显色AOD,与模型组相比具有显著地统计学差异。结论：高乌甲素16mg/kg可以抑制脊髓背角中胶质细胞、原癌基因、一氧化氮合酶及DRG中的P2X3受体激活,表明高乌甲素对于炎性疼痛及其痛觉过敏的产生均有抑制作用。第三部分羟考酮伍用高乌甲素的药效学研究初探1羟考酮与高乌甲素联合应用的配伍研究目的：应用正交试验设计,通过小鼠热板实验和醋酸扭体实验,确定高乌甲素与羟考酮配伍应用的最佳比例。方法：根据临床中氢溴酸高乌甲素片和盐酸羟考酮片的用量,选定羟考酮实验剂量为4mg/kg.5mg/kg.6mg/kg,高乌甲素实验剂量为4mg/kg、8mg/kg.12mg/kg,按照L9(34)正交实验设计,并设立两个空白对照和对照组,即0-9组；用小鼠热板实验法测定给药后30min、60min、90min及120min时间点的小鼠舔足潜伏时并计算痛阈提高百分率,用小鼠醋酸扭体法测定小鼠在腹腔注射冰醋酸后20min内的扭体次数。结果：在小鼠醋酸扭体实验中,羟考酮6mg/kg伍用高乌甲素12mg/kg对提高小鼠扭体潜伏时效果最好,羟考酮6mg/kg伍用高乌甲素8mg/kg对减少小鼠扭体次数的效果最好,正交分析结果显示高乌甲素与羟考酮不同剂量的变化因素对于小鼠醋酸扭体实验的影响没有差异；在小鼠热板实验中,羟考酮4mg/kg.6mg/kg和高乌甲素8mg/kg.12mg/kg配伍时,对于提高小鼠人办痛阈提高百分率的影响最大,正交分析结果显示羟考酮5mg/kg伍用8mg/kg高乌甲素作用最好。结论：羟考酮和高乌甲素配伍后对于小鼠的醋酸扭体反应和热板疼痛反应均有明显镇痛作用,以L9(34)正交实验统计结果并结合直观分析结果,确定高乌甲素与羟考酮按照8：5比例配伍时,效果最为理想。2羟考酮伍用高乌甲素对慢性炎性疼痛的影响目的：研究羟考酮伍用高乌甲素对慢性炎性大鼠机械伤害感受阈值的改善所用。方法：高乌甲素与羟考酮按照8：5的比例进行配伍,在大鼠建模第7天开始给药,连续给药6天,在建模前、建模第6天、第9天、第12天及末次给药后18h测量实验动物的机械伤害感受阈值,第9天、第12天均在给药后1h进行测量。结果：羟考酮2.8mg/kg伍用高乌甲素4.48mg/kg、羟考酮0.7mg/kg伍用高乌甲素1.12mg/kg对模型大鼠的机械伤害感受阈值没有影响；羟考酮1.4mg/kg伍用2.24mg/kg高乌甲素在建模第12天即给药6天时对于大鼠机械伤害感受阈值出现提高作用,与模型组相比具有统计学差异。结论：高乌甲素1.12mg/kg.2.24mg/kg.4.48mg/kg分别与羟考酮0.7mg/kg.1.4mg/kg.2.8mg/kg进行伍用时对于慢性炎性大鼠的机械刺激疼痛反应几乎没有作用效果。3羟考酮伍用高乌甲素对热刺激疼痛反应的影响研究目的：采用小鼠热板疼痛实验考察羟考酮伍用高乌甲素对热刺激疼痛的作用。方法：应用小鼠热板疼痛模型,测定小鼠在给药后30min、60min、90min及120min时间点的热板舔足潜伏时并计算痛阈提高反应率。结果：羟考酮4mg/kg伍用高乌甲素6.4mg/kg对于延长小鼠热板舔足潜伏时和提高痛阈百分率的作用效果均较好,且起效迅速,较羟考酮4mg/kg的作用效果更好,而羟考酮2mg/kg伍用高乌甲素3.2mg/kg几乎没用作用。结论：羟考酮4mg/kg伍用高乌甲素6.4mg/kg对热刺激疼痛反应的镇痛效果较好。综上所述,大鼠足底皮下注射完全弗氏佐剂可以成功建立慢性炎性疼痛模型；高乌甲素16mg/kg可以有效提高CFA大鼠的机械伤害感受阈值,产生镇痛作用,但由于使用剂量过大,高乌甲素的治疗窗较窄的原因,此剂量高乌甲素可能会造成毒性反应；高乌甲素可以有效抑制脊髓胶质细胞、原癌基因、一氧化氮合酶及P2X3受体的激活,证明高乌甲素有抑制痛觉过敏的作用,同时完善了高乌甲素在脊髓水平的镇痛抗炎作用机制。羟考酮伍用高乌甲素的复方药物对于大鼠的机械刺激疼痛反应的镇痛作用不明显,且弱于相同剂量羟考酮单用的镇痛效果；羟考酮4mg/kg伍用高乌甲素6.4mg/kg对小鼠热刺激疼痛反应的镇痛作用较强,同时强于羟考酮4mg/kg作用效果；综合来看,由于复方药物在高剂量时才表现出微弱的镇痛作用,没有体现复方药物的优势,所以羟考酮与高乌甲素配伍应用治疗疼痛在药效学上没有意义。

全文目录

目录  3-5
中文摘要  5-9
ABSTRACT  9-14
综述一痛觉过敏发生机制的研究进展  14-24
  参考文献  20-24
综述二高乌甲素现代研究进展  24-38
  参考文献  32-38
前言  38-43
  参考文献  40-43
第一部分慢性炎性疼痛大鼠模型的建立  43-51
  材料与方法  43-45
  结果  45-48
  小结  48-49
  讨论  49-50
  参考文献  50-51
第二部分高乌甲素抗痛觉过敏机制研究  51-62
  第一节高乌甲素对大鼠慢性炎性疼痛的影响  51-55
    材料与方法  52-53
    结果  53-54
    小结  54-55
  第二节高乌甲素对CFA大鼠脊髓胶质细胞、c-fos、NOS和P2X_3受体表达的影响研究  55-58
    材料与方法  55-57
    结果  57-58
    小结  58
  讨论  58-60
  参考文献  60-62
第三部分羟考酮伍用高乌甲素的药效研究初探  62-80
  第一节高乌甲素与羟考酮联合应用的配伍研究  62-70
    材料和方法  62-64
    结果  64-69
    小结  69-70
  第二节羟考酮伍用高乌甲素对慢性炎性疼痛的影响  70-74
    材料和方法  70-71
    结果  71-72
    小结  72-74
  第三节羟考酮伍用高乌甲素对热刺激反应的影响研究  74-76
    材料和方法  74-75
    结果  75-76
    小结  76
  讨论  76-78
  参考文献  78-80
结语与展望  80-83
附图  83-88
致谢  88-89
个人简历  89

高乌甲素抗痛觉过敏机制研究及羟考酮伍用高乌甲素药效学研究初探

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