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链酶和素修饰CdSe/ZnS量子点在食源性致病细菌检测中的应用研究

作　者: 黄爱华
导　师: 李君文
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 劳动卫生与环境卫生学
关键词: 量子点基因芯片 PCR 检测
分类号: R155.5
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

量子点是一种新型的半导体纳米晶体材料。作为一种荧光标记探针，它展现出传统荧光染料所没有的许多光化学优点。首先，量子点具有宽的吸收光谱,窄而对称的发射光谱，可以实现单波长同时激发不同量子点；其次量子点光化学稳定性强，经长时间光源照射荧光特性不受损失，抗光漂白性能强；最后，虽然不同尺寸的量子点具有不同的荧光发射波长(颜色),但是它们都具有良好方便的表面化学可修饰性，以及表面生物分子偶联的灵活可兼容特性,能与生物活性分子进行有效的偶联。近年来，量子点在基因分析、免疫分析、微生物检测等方面得到广泛应用。本论文的主要工作是将链酶亲和素修饰的CdSe/ZnS量子点分别引入到基因芯片技术与聚合酶链反应技术之中，建立了链酶亲和素修饰的CdSe/ZnS量子点标记的基因芯片检测平台，同时探讨了链酶亲和素修饰的CdSe/ZnS量子点对于聚合酶链反应技术的影响作用。具体研究工作如下：1.应用链酶亲和素修饰的CdSe/ZnS量子点作为荧光标记物的基因芯片检测食源性致病细菌检测方法的建立基因芯片技术具有高通量、高速度、高效率的检测特征，为环境微生物的检测鉴定提供了强有力的检测工具。但是目前以荧光有机染料为主要标记物的基因芯片技术，存在检测灵敏度低，重复性差等技术上的缺陷，主要限制性原因是，荧光有机染料存在很多缺陷（如，荧光强度不高、稳定性差、易被光漂白）。量子点是半导体纳米材料，具有优良的光学特性，本研究借助链酶亲和素修饰的CdSe/ZnS量子点的优良荧光特性，将其与基因芯片技术相互融合，建立了链酶亲和素修饰的CdSe/ZnS量子点标记的基因芯片检测平台，并将其应用于食源性致病细菌的检测之中。具体实验方法为，将细菌16S rDNA基因作为检测的靶基因，设计合成食源性致病细菌的寡核苷酸检测探针，应用生物芯片点样仪将氨基化寡核苷酸检测探针点至于醛基化的载玻片上制备基因芯片；合成生物素化修饰的通用引物，借助PCR反应，将生物样品标记上生物素；将生物素化的生物样品与制备好的基因芯片进行杂交，然后应用链酶亲和素标记的CdSe/ZnS量子点与基因芯片进行温育，借助生物素-链酶亲和素系统，将链酶亲和素修饰的CdSe/ZnS量子点标记到生物素化生物样品-寡核苷酸探针杂交复合物上。应用生物芯片扫描仪检测杂交信号。将建立的链酶亲和素修饰的CdSe/ZnS量子点标记的基因芯片检测平台，应用到多种食源性致病细菌的快速检测之中，结果表明该方法能够有效区分Vibrioparahaemolyticus, Vibrio fluvialis, Yersinia enterocolitica, Proteus spp.,Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Campylobacter jejuni, Streptococcushemolytic-β, Listeria monocytogenes，而Escherichia coli, Shigella spp., Salmonellaspp.作为一类菌被检出，展现了良好的检测特异性。敏感性指标亦是评价检测技术的重要参数之一,目前提高检测灵敏度可从以下方面进行考虑：选用性质优良的标记物与采用优良的信号放大方法。其中标记物的性质是决定灵敏度高低的主要因素，优良的标记物质应具有安全，灵敏，即不具有放射性，发光效率高，并且化学性质应较为稳定，标记方法简便，发光信号稳定长久便于检测。而在目前的标记信号报告分子中，能够同时符合以上要求的只有量子点，因此本研究采用链酶亲和素修饰的CdSe/ZnS量子点作为基因芯片的荧光标记物，提高基因芯片检测技术的灵敏性。同时在本研究中，引入了生物素-链霉亲和素信号放大系统，来配合量子点标记技术提升基因芯片的灵敏度，研究发现，量子点标记的基因芯片检测方法的检测敏感性为10cfu/ml，较荧光有机染料标记的基因芯片检测方法有所提升。并且量子点标记的基因芯片技术重复性良好。为了评估量子点标记的基因芯片技术在实际样品中的应用能力，我们将该方法应用于32株从不同食品样本中分离的菌株，进行检测鉴定，同时将检测结果，与常规检测方法进行了比较，二者的符合率达到100%。该检测方法对于病原菌的检测鉴定能够在7-8h内完成。本研究建立的链酶亲和素修饰的CdSe/ZnS量子点标记的基因芯片检测方法的实验思路同样适于其它致病微生物的检测，为利用量子点标记的基因芯片检测鉴定致病微生物奠定了技术基础。2.链霉亲和素修饰的CdSe/ZnS量子点对聚合酶链式反应技术的影响聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction, PCR）是现代生物学中非常重要的实验技术，自从1983年发明以来，它已经成为生命科学研究的重要研究工具，促进了生命科学研究的发展，在其发展过程中，研究者不断对其扩增效果进行改进，目前，纳米材料被引入PCR体系中，改善其反应效果。量子点是半导体纳米材料，由于其具有出色的光学性能，而备受关注，但是，目前对量子点的其它特性，例如其表面基团及分子结构的化学效应关注不多，我们率先将链酶亲和素修饰的量子点引入到PCR扩增体系中，研究其对PCR反应效果的影响。本部分研究借助PCR技术和琼脂糖凝胶电泳技术，研究链酶亲和素修饰的CdSe/ZnS量子点对于PCR反应的影响作用。观察不同浓度的链酶亲和素修饰的CdSe/ZnS量子点对PCR特异性的影响；同时，将特定浓度的链酶亲和素修饰的CdSe/ZnS量子点加入到PCR体系中，观察其对退火温度的影响；将牛血清白蛋白（BSA）加入到含有一定浓度链酶亲和素修饰的CdSe/ZnS量子点的反应体系中，观察其对PCR扩增效能的影响；同时将不同公司来源的Taq酶加入到含有一定浓度的链酶亲和素修饰的CdSe/ZnS量子点的PCR反应体系中,观察相应的实验结果。实验结果表明，一定浓度范围内的链酶亲和素修饰的CdSe/ZnS量子点可以促进PCR的扩增效果，拓宽退火温度，增强PCR的扩增能力；超过一定浓度的链酶亲和素修饰的CdSe/ZnS量子点抑制PCR的扩增效果；BSA能够逆转链酶亲和素修饰的CdSe/ZnS量子点对于PCR的作用；当使用不同公司来源的TaqDNA聚合酶时，若想获得同样效果的扩增结果，所需的链酶亲和素修饰的CdSe/ZnS量子点的浓度不同。量子点可能是通过与Taq DNA聚合酶的作用影响了PCR反应的扩增效能，在一定的浓度范围内，量子点可以有效地促进PCR的扩增效能。

全文目录

缩略词  6-7
中文摘要  7-10
Abstract  10-13
第一章引言  13-21
  1. 量子点的定义及结构  13-14
  2. 量子点的合成制备方法  14-15
    2.1 在有机相合成  14-15
    2.2 在水相合成  15
  3.量子点的表面修饰  15-16
    3.1 表面巯基修饰  15
    3.2 具有亲水性质的无机物修饰  15-16
    3.3 聚合物包裹  16
    3.4 依靠静电引力将生物分子连接到量子点表面  16
  4. 量子点的光学性质  16-18
    4.1 宽的吸收光谱，窄而对称的荧光发射光谱  16-17
    4.2 量子点的发射波长可以调节  17
    4.3 量子点的荧光强度强，并具有良好的光学稳定性  17
    4.4 量子点的生物性相容性好  17-18
  5. 量子点的生物学应用  18-20
    5.1 量子点在分子水平检测中的应用  18
    5.2 量子点在细胞水平检测中的应用  18-19
    5.3 量子点在微生物检测中的应用  19-20
  6. 课题思路  20-21
第二章链酶亲和素修饰的 CDSE/ZNS 量子点标记的基因芯片检测系统在食源性致病细菌中的检测研究  21-63
  前言  21-23
  一. 链酶亲和素修饰的 CDSE/ZNS 量子点标记的基因芯片检测系统的优化研究  23-48
    1. 实验材料  23-24
      1.1 菌种  23
      1.2 主要试剂及来源  23-24
      1.3 主要仪器  24
    2. 实验方法  24-29
      2.1. 主要试剂的配置  24
      2.2 菌株的培养  24-25
      2.3 DNA的提取  25
      2.4 检测靶基因的确定  25
      2.5 通用引物的设计  25
      2.6 探针的选择设计  25
      2.7 通用引物PCR扩增实验  25-26
      2.8 扩增产物电泳检查结果  26
      2.9 寡核苷酸基因芯片的制备方法  26
      2.10 点样后芯片的处理方法  26
      2.11 样品的生物素标记方法  26
      2.12 不对称PCR扩增试验的优化  26-27
      2.13 生物素标记的PCR扩增产物与寡核苷酸基因芯片杂交  27
      2.14 生物素标记的PCR扩增产物与寡核苷酸基因芯片杂交后的处理方法  27
      2.15 链酶亲和素修饰的CdSe/ZnS 量子点标记  27-28
      2.16 链酶亲和素修饰的CdSe/ZnS量子点标记后的芯片的处理方法  28
      2.17 链酶亲和素修饰的CdSe/ZnS量子点标记的基因芯片杂交体系的优化  28
      2.18 扫描和结果分析  28-29
    3．结果  29-44
      3.1 本研究检测的食源性致病细菌  29
      3.2 靶基因选择结果  29
      3.3 通用引物设计的结果  29
      3.4 探针设计的结果  29
      3.5 寡核苷酸芯片的制备结果  29
      3.6 杂交液的选择  29-30
      3.7. 正交实验设计实验结果  30
      3.8. 不对称PCR优化的结果  30-44
    4 讨论  44-48
  三．链酶亲和素修饰的 CDSE/ZNS 量子点标记的基因芯片检测效能评价  48-58
    1. 实验材料  48-49
      1.1 菌种  48
      1.2 主要试剂及来源  48
      1.3 主要仪器  48-49
    2. 实验方法  49-52
      2.1. 主要试剂的配置  49
      2.2 基因芯片特异性实验  49-50
      2.3 基因芯片敏感性实验  50-51
      2.4 基因芯片的重复性实验  51-52
    3. 结果  52-56
      3.1 基因芯片特异性实验结果  52
      3.2 敏感性实验结果  52
      3.3 基因芯片的重复性实验  52-56
    4. 讨论  56-58
  四．初步应用实验  58-63
    1. 实验材料  58
      1.1 仪器、试剂  58
      1.2 分离菌株的来源：  58
    2. 实验方法  58-59
      2.2 DNA提取  58
      2.3 样品的生物素标记方法  58
      2.4 基因芯片的杂交检测方法  58-59
      2.5. 常规检测方法  59
    3．结果  59-62
      3.1 对食品分离菌株的检测  59-62
    4. 讨论  62-63
第三章链酶亲和素修饰的CDSE/ZNS量子点对聚合酶链反应的影响作用研究  63-77
  前言  63-65
  1. 实验材料  65-66
    1.1 受试菌种  65
    1.2 主要试剂及来源  65
    1.3 主要仪器  65-66
  2. 实验方法  66-69
    2.1 评估不同浓度的 SA-CdSe/ZnS 量子点对PCR扩增结果的影响  66
    2.2 评估一定浓度的SA-CdSe/ZnS 量子点对 PCR不同退火温度的扩增特异性的影响  66-67
    2.3 评估不同浓度的BSA对量子点PCR的效果影响  67
    2.4 评价不同公司来源的DNA聚合酶与不同浓度的SA-CdSe/ZnS量子点组合，对于PCR效果的影响  67-68
    2.5 评估 PCR 扩增体系中不同浓度的SA-CdSe/ZnS量子点与不同浓度的DNA聚合酶组合,对于PCR效果的影响  68-69
  3. 结果  69-75
    3.1 不同浓度的 SA-CdSe/ZnS 量子点对 PCR 扩增结果的影响  69-70
    3.2 一定浓度的 SA-CdSe/ZnS 量子点对不同退火温度的扩增特异性的影响  70-71
    3.3 不同浓度的BSA对量子点PCR的效果影响  71-72
    3.4 不同公司的聚合酶对于不同浓度的 SA-CdSe/ZnS量子点 PCR 效果的影响  72-73
    3.5 反应体系中 Taq 酶不同浓度对于量子点 PCR 的影响  73-74
    3.6 PCR扩增体系中含有 0.7 nmol/L的链霉亲和素修饰的量子点时 PCR 敏感性  74-75
  4. 讨论  75-77
结论  77-78
参考文献  78-85
附录  85-90
综述  90-99
  参考文献  96-99
博士期间发表文章情况  99-100
论著  100-105
个人简历  105-106
致谢  106

链酶和素修饰CdSe/ZnS量子点在食源性致病细菌检测中的应用研究

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