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家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）功能基因组研究-家蚕微孢子虫两种假定孢壁蛋白HSWP11、HSWP13的鉴定

作　者: 周小伟
导　师: 潘国庆; 周泽扬
学　校: 西南大学
专　业: 微生物学
关键词: 家蚕微孢子虫孢壁蛋白重组蛋白表达免疫定位孢子粘附
分类号: S884.6
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

微孢子虫（microsporidia）是一大群营专性细胞内寄生的真核生物的总称,能感染从无脊椎动物到脊椎动物的几乎所有动物,包括人类。微孢子虫能抵御各种环境压力,这得益于其表面一层厚厚的孢壁,其由外壁、内壁及原生质膜组成。目前微孢子虫分子水平的研究相对薄弱,对孢壁蛋白研究不够深入,目前仅鉴定并报道12个孢壁蛋白,对微孢子虫侵染的分子机制尚不明确。近年来研究发现,微孢子虫在侵染过程中有粘附的现象,而孢壁作为最先与宿主细胞接触的部分在孢子侵染宿主细胞的过程中扮演着重要角色。像其它病原（如疟原虫、弓形虫等）的表面蛋白一样,微孢子虫孢壁的重要组分孢壁蛋白被认为参与宿主细胞的粘附,在侵染过程中起重要作用。家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）是1857年人类首次鉴定出的微孢子虫,它能引发微粒子病并通过胚胎垂直传播,造成养蚕业的重大损失。家蚕微孢子虫孢壁蛋白的研究有助于阐明微孢子虫的侵染机制,从而可以为微粒子病的防治提供作用靶标。目前在家蚕微孢子虫中仅鉴定报道5个孢壁蛋白,因此有待于新的孢壁蛋白鉴定。本研究基于吴正理等人从家蚕微孢子虫鉴定出14个假定孢壁蛋白的基础,以其中假定孢壁蛋白11NbHSWP11和假定孢壁蛋13NbHSWP13为对象,分析了其序列特征,采用RT-PCR方法检测了其转录活性,并进行了原核重组蛋白的表达和抗体的制备；进一步应用间接免疫荧光分析NbHSWP11、NbHSWP13在家蚕微孢子虫中的亚细胞定位；在此基础上,采用酿酒酵母表达系统对NbHSWP13进行体外亚细胞定位分析；同时,利用细胞结合试验和抗体封闭试验来探索NbSWP11在家蚕微孢子虫孢子粘附感染宿主细胞时起的作用。主要研究结果如下：1.家蚕微孢子虫假定孢壁蛋白Nbhswpll基因表达及多克隆抗体的制备利用生物信息学方法和软件对Nbhswp11序列进行分析,其由447个氨基酸组成（52.3kDa,pI为9.71）,其序列预测含6个肝素结合基序（HBM）、32个预测的磷酸化位点及一个含保守的Dna J domain,没有预测的信号肽、糖基化位点、跨膜结构域及GPI锚定位点。二级结构预测显示片段主要以a螺旋为主,无规卷曲次之；共线性分析表明,Nbhswp11基因与蜜蜂微孢子虫Dna J domain编码基因在各自基因组位置相对保守。转录活性表明,家蚕微孢子虫感染后Nbhswp11基因均有转录。在以上分析基础上,设计引物,构建了pET30a（+）-Nbhswp11重组原核表达载体,转入E. coli BL21原核表达系统,诱导表达,获得预期的rNbHSWP11重组蛋白,主要以包涵体形式存在。通过镍柱亲和层析后,制备了纯化的融合蛋白,并以其作为抗原免疫小鼠,获得特异性的抗血清。免疫印迹分析表明制备的抗血清在成熟的微孢子虫总蛋白和孢壳蛋白均可以识别NbHSWP11天然蛋白条带,初步判定NbHSWP11是家蚕微孢子虫的一个孢壁蛋白。2.家蚕微孢子虫假定孢壁蛋白NbHSWP11的定位分析及功能初探采用免疫荧光法进行了NbHSWP11在家蚕微孢子虫的定位分析,结果在HSWP11抗血清标记的孢子和孢壳均观察到强烈的绿色荧光信号,这充分表明NbHSWP11定位在孢壁上,是家蚕微孢子虫新鉴定的一个孢壁蛋白,更名为NbSWP11。基于此研究结果,我们在体外进行细胞结合实验,结果表明天然NbSWP11能识别并结合宿主细胞表面,推测其在孢子粘附侵染过程中发挥重要作用。因此,我们进行了NbSWP11抗体封闭验证试验,结果发现,与阴性抗体对照相比,SWP11被抗体封闭后会降低孢子对宿主细胞的粘附,抑制率达20%,表明SWP1l在孢子的粘附侵染过程中会起某种促进作用。3.家蚕微孢子虫假定孢壁蛋白Nbhswpl3基因的表达及多克隆抗体的制备在家蚕微孢子虫基因库,NBO₄62g0007开放阅读框编码由833个氨基酸组成的NbHSWP13蛋白（94.3kDa,pI7.42）,预测有核定位信号,N端存在17个氨基酸组成的信号肽,而靠近C端有一段由疏水氨基酸占多数的30个氨基酸组成的特征基序；除信号肽剪切外,序列上还有2个胰蛋白酶剪切位点；无跨膜结构域和保守的功能结构域,二级结构简单松散,主要是无规卷曲；序列比对显示,家蚕微孢子虫NbHSWP13与柞蚕微孢子虫假定孢壁蛋白13NaHSWP13全长序列同源性高达78%,而共线性分析表明,hswp13在各自基因组中的位置相对保守。RT-PCR结果表明,Nbhswp13在感染后的12h就检测到转录本,推测（?）NbHSWP13在孢子生活史的早期就扮演着重要的角色。基于功能结构域预测,我们截取了NbHSWP13N端的除去信号肽而含两个内部重复基序的382个氨基酸的片段,C端含特征基序的201个氨基酸的片段；对该两片段进行原核表达引物设计,构建ppET30a（+）-nbhswpl3n、 ppET30a（+）-nbhswp13c外源表达载体,转入E. coli Rosetta感受态细胞,分别在37℃、28℃用IPTG诱导表达；SDS-PAGE电泳检测显示,NbHSWP13N融合蛋白比理论分子量偏大约5kDa而NbHSWP13C融合蛋白偏大约12kDa,经镍柱亲和层析,纯化后两重组蛋白单一带分别用Western boltting和质谱鉴定,结果表明,该单一带均是目的蛋白条带。将TNbHSWP13N与NbHSWP13C作为抗原,分别制备相应的抗体。成熟孢子总蛋白、未成熟孢子总蛋白及感染后中肠蛋白分别与制备的两抗体杂交反应均获得比理论预测偏小约24kDa的信号带,结合该蛋白存在酶剪切位点,我们推（?）（?）NbHSWP13N端某一位点发生剪切致使蛋白偏小。4.家蚕微孢子虫假定孢壁蛋白NbHSWP13定位分析首先,我们采用间接免疫荧光试验分析了假定孢壁蛋白NbHSWP13在家蚕微孢子虫的定位情况。结果显示,在成熟的孢子中,未观察到绿色荧光信号,表明NbHSWP13没有分布在外壁,因此,我们用分离的未成熟孢子经TritonX处理后在进行IFA,结果在孢子壁上观察到绿色的荧光信号；接着我们用载玻片孢子发芽的样品进行免疫荧光分析,结果在孢壳上观察到绿色的荧光信号,以上结果表明,假定孢壁蛋白NbHSWP13定位在孢子内壁。随后,我们利用模式生物酿酒酵母表达系统进行NbHSWP13的表达定位分析,以供参考。先构建了带信号肽的pUG35-nbhswpl3n-sp和不带信号肽的pUG35-nbhswpl3n-Asp酵母定位载体,电转酿酒酵母CEN.PK2。经SC-Ura培养基平板筛选阳性重组酵母,用诱导培养基表达带GFP标签的融合蛋白,提取重组酵母基因组和重组酵母总蛋白进行PCR和Western blotting验证后,诱导后重组酵母菌再用DNA染料DAPI染色,在荧光显微镜下观察。结果表明,NbHSWP13N-SP和NbHSWP13N-ASP重组蛋白定位于酿酒酵母细胞核,这验证了该蛋白核定位的亚细胞预测结果,同时说明NbHSWP13的N端信号肽无核靶向功能。

全文目录

摘要  8-11
ABSTRACT  11-15
第一章文献综述  15-29
  1.1 概述  15-16
  1.2 微孢子虫的生活史  16-17
  1.3 微孢子虫的侵染机制  17-22
  1.4 微孢子虫蛋白质研究进展  22-29
    1.4.1 微孢子虫蛋白质组的研究  22-23
    1.4.2 微孢子虫孢壁蛋白的研究  23-29
第二章引言  29-33
  2.1 研究背景  29
  2.2 家蚕微孢子虫孢壁蛋白研究目的和意义  29-30
  2.3 主要研究内容  30
  2.4 研究技术路线  30-33
第三章家蚕微孢子虫假定孢壁蛋白Nbhswp11的表达及抗体制备  33-55
  3.1 材料与方法  33-46
    3.1.1 材料  33-34
    3.1.2 工具及软件  34
    3.1.3 主要试剂与仪器  34-38
    3.1.4 主要方法  38-46
  3.2 结果与分析  46-52
    3.2.1 家蚕微孢子虫Nbhswp11基因的序列特征分析  46-49
    3.2.2 家蚕微孢子虫Nbhswp11基因的转录特征分析  49-50
    3.2.3 家蚕微孢子Nbhswp11基因原核表达载体的构建  50-51
    3.2.4 家蚕微孢子虫Nbhswp11的原核表达及纯化  51
    3.2.5 家蚕微孢子虫NbHSWP11的多克隆抗体的制备及免疫印迹分析  51-52
  3.3 结论与讨论  52-55
第四章家蚕微孢子虫假定孢壁蛋白NbHSWP11定位分析及功能初探  55-63
  4.1 材料与方法  55-57
    4.1.1 材料  55
    4.1.2 主要试剂与仪器  55
    4.1.3 主要方法  55-57
  4.2 结果与分析  57-60
    4.2.1 家蚕微孢子虫NbHSWP11在成熟孢子及孢壳的间接免疫荧光分析  57-59
    4.2.2 家蚕微孢子虫NbSWP11与BmE细胞结合  59
    4.2.3 家蚕微孢子虫NbSWP11的抗体封闭对孢子粘附细胞的影响  59-60
  4.3 结论与讨论  60-63
第五章家蚕微孢子虫假定孢壁蛋白Nbhswpl3表达及多克隆抗体的制备  63-89
  5.1 材料与方法  63-69
    5.1.1 材料  63
    5.1.2 工具及软件  63
    5.1.3 主要试剂与仪器  63
    5.1.4 主要方法  63-69
  5.2 结果与分析  69-85
    5.2.1 家蚕微孢子虫Nbhswp13基因的生物信息学分析  69-75
    5.2.2 家蚕微孢子虫Nbhswp13基因转录活性分析  75
    5.2.3 家蚕微孢子虫的纯化和基因组DNA的提取  75-76
    5.2.4 家蚕微孢子虫Nbhswp13基因的TA克隆及重组表达载体的构建  76-78
    5.2.5 家蚕微孢子虫Nbhswp13基因的原核表达和蛋白表达形式鉴定  78-79
    5.2.6 家蚕微孢子虫NbHSWP13重组蛋白纯化及验证  79-81
    5.2.7 蚕微孢子虫NbHSWP13的多克隆抗体制备及ElISA法效价测定  81-82
    5.2.8 家蚕微孢子虫NbHSWP13的免疫印迹分析  82-85
  5.3 结论与讨论  85-89
第六章家蚕微孢子虫假定孢壁蛋白NbHSWP13定位分析  89-105
  6.1 材料与方法  89-95
    6.1.1 材料  89
    6.1.2 主要试剂与仪器  89-91
    6.1.3 主要方法  91-95
  6.2 结果与分析  95-103
    6.2.1 NbHSWP13在家蚕微孢子虫的间接免疫定位定位分析  95-98
    6.2.2 家蚕微孢子虫NbHSWP13在酿酒酵母的表达及定位  98-103
  6.3 结论与讨论  103-105
第七章综合与结论  105-109
论文的创新点  109-111
参考文献  111-119
在读期间发表的文章及参研课题  119-121
致谢  121-123
附录  123-124

家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）功能基因组研究-家蚕微孢子虫两种假定孢壁蛋白HSWP11、HSWP13的鉴定

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