学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

TGEV S蛋白D位点和胞壁酰二肽及促吞噬素在干酪乳杆菌中的表达和免疫效果评价

作　者: 姜新鹏
导　师: 李一经
学　校: 东北农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪传染性胃肠炎病毒 S蛋白D位点胞壁酰二肽促吞噬素干酪乳杆菌
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 30次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of swine, TGEV)能够引起不同年龄和品种的猪发生以呕吐、严重腹泻和脱水为特征的胃肠炎，该病是一种高度传染性病毒性肠道疾病,两周龄以内的仔猪致死率可达100%。黏膜免疫是对本病免疫保护的最佳途径。本研究选用TGEV S蛋白中能够诱导机体产生中和抗体的非糖基化的线性表位D抗原位点作为靶基因片段，通过乳酸菌系统对其进行表达，同时选择胞壁酰二肽和促吞噬素与D位点共表达，分析评价其对特异性免疫应答的影响。本实验首先对胞壁酰二肽（Muramyl dipeptide，MDP）和促吞噬素（Tuftsin）二十聚体（20MT）进行密码子优化后，串联形成四十聚体（40MT）。分别将20MT和40MT与6D相连，然后将6D、20MT-6D和40MT-6D分别克隆到pPG612载体中，电转化干酪乳杆菌感受态细胞中，获得阳性重组菌,分别命名为rLc:pPG612-6Ds、rLc:pPG612-20MT-6Ds、rLc:pPG612-40MT-6Ds。将重组菌rLc:pPG612-6Ds、rLc:pPG612-20MT-6Ds和rLc:pPG612-40MT-6Ds在2%D-木糖MRS培养基中诱导后，进行Western-blot检测，结果表明：目的蛋白获得表达，蛋白大小分别为27kDa、43kDa、59kDa，符合预期大小；取诱导后的培养上清，进行ELISA检测，结果表明，三组重组菌经诱导后，目的蛋白均获得了分泌表达。将6-8周龄BALB/c小鼠随机分成5组，每组12只，口服免疫，分别为鲜奶对照组、rLc:pPG612组、rLc:pPG612-6Ds、rLc:pPG612-20MT-6Ds和rLc:pPG612-40MT-6Ds组。口服免疫活菌量为109个/只，连续三天灌服，每隔1周加强免疫一次，共免疫三次。分别于免疫前和免疫后定期采集各组血清、粪便、泪液、鼻黏液、外生殖道黏液。通过间接ELISA检测，进行数据统计分析，结果表明，rLc:pPG612-20MT-6Ds和rLc:pPG612-40MT-6Ds免疫组特异性IgA和IgG抗体水平均明显高于rLc:pPG612-6Ds，且rLc:pPG612-20MT-6Ds免疫组抗体水平要高于rLc:pPG612-40MT-6Ds免疫组。细胞中和试验结果表明， rLc:pPG612-6Ds， rLc:pPG612-20MT-6Ds和rLc:pPG612-40MT-6Ds组免疫小鼠所得血清的中和效价分别为1:15、1：32和1:60，肠黏膜抗体IgA中和效价分别为1:32、1:51和1:64。研究结果表明，口服免疫表达6Ds、20MT-6D和40MT-6Ds蛋白的重组乳酸菌均能诱导产生系统免疫和黏膜免疫，经口服免疫后，诱导产生的黏膜免疫反应不仅局限于胃肠道，还可以诱导其他黏膜部位产生特异性免疫反应。将新分离的免疫鼠脾细胞稀释成5×106个/mL，经流式细胞术检测Th细胞亚类Th1、Th2、 Th17和Treg，分析MT在Th细胞水平上对免疫调节的作用途径。实验结果表明，rLc:pPG612-20MT-6Ds和rLc:pPG612-40MT-6D组的Th1、Th2和Th17相对于rLc:pPG612-6D组和rLc:pPG612组有明显的增高，且差异极显著。rLc:pPG612-20MT-6Ds组的Th亚类细胞都明显高于rLc:pPG612-40MT-6D组，且差异极显著。 rLc:pPG612-20MT-6Ds和rLc:pPG612-40MT-6D组Th1/Th2细胞均发生明显平衡漂移，分析确定MT为Th1类型佐剂。同时，检测Th17和Treg细胞水平，结果表明：rLc:pPG612-6Ds、rLc:pPG612-20MT-6Ds和rLc:pPG612-40MT-6Ds三组的Th17细胞水平相对于rLc:pPG612明显上调，且差异极显著，rLc:pPG612-40MT-6Ds组显著高于rLc:pPG612-20MT-6Ds组。rLc:pPG612-20MT-6Ds组和rLc:pPG612-40MT-6Ds组的Treg细胞水平相对于对照组rLc:pPG612和rLc:pPG612-6Ds组明显降低，且差异极显著。rLc:pPG612-40MT-6Ds组的Treg细胞水平与rLc:pPG612-20MT-6Ds组相比，下降更明显，且差异极显著。以上结果表明：MT为Th1型免疫增强剂，不仅可以增强特异性免疫应答水平，同时也具有调节免疫机制和抗免疫抑制的作用。综上所述，本研究重组的干酪乳杆菌不仅诱导产生了体液免疫和黏膜免疫，同时胞壁酰二肽和促吞噬素（MT）还增强了体液免疫和黏膜免疫应答水平，并作为一种Th1型佐剂产生细胞免疫应答，同时增强Th17细胞活性发挥佐剂功能，并具有抗免疫抑制作用。为进一步研制预防TGEV有效的口服疫苗奠定了基础，并为新型免疫佐剂的研制提供参考。

全文目录

目录  4-6
CONTENTS  6-8
摘要  8-10
Abstract  10-12
1 前言  12-23
  1.1 猪传染性胃肠炎的流行及其危害  12-13
  1.2 猪传染性胃肠炎病毒分类及其结构特征  13-15
    1.2.1 猪传染性胃肠炎病毒形态特征  13
    1.2.2 不同猪传染性胃肠炎病毒的抗原性分析  13-14
    1.2.3 猪传染性胃肠炎病毒基因组结构特点  14-15
  1.3 猪传染性胃肠炎病毒致病机制和免疫机制  15-16
    1.3.1 猪传染性胃肠炎病毒的致病机制  15-16
    1.3.2 猪传染性胃肠炎病毒免疫机制的研究  16
  1.4 乳酸菌抗腹泻效应及其应用  16-17
  1.5 乳酸菌作为表达载体的研究进展  17-18
  1.6 疫苗免疫佐剂分类及其研究进展  18-21
    1.6.1 免疫佐剂的分类及作用机理  18-20
    1.6.2 免疫佐剂的研究现状  20
    1.6.3 促吞噬素的研究进展  20-21
    1.6.4 胞壁酰二肽的研究进展  21
  1.7 研究的目的与意义  21-23
2 材料与方法  23-34
  2.1 材料  23-24
    2.1.1 菌种、质粒  23
    2.1.2 抗体制剂  23
    2.1.3 实验动物  23
    2.1.4 主要分子生物学试剂  23-24
    2.1.5 主要实验仪器与设备  24
  2.2 实验方法  24-34
    2.2.1 40MT 基因片段的制备  24-26
    2.2.2 目的基因 20MT-6Ds 和 40MT-6Ds 的制备  26-27
    2.2.3 重组干酪乳杆菌的构建  27-30
    2.2.4 重组干酪乳杆菌的诱导表达  30-31
    2.2.5 口服重组干酪乳杆菌免疫学指标的测定  31-34
3 结果与分析  34-47
  3.1 重组干酪乳杆菌的构建  34-37
    3.1.1 目的基因 40MT 的获得  34
    3.1.2 目的基因 20MT6Ds 和 40MT6Ds 的获得  34-36
    3.1.3 重组干酪乳杆菌表达载体的鉴定结果  36-37
  3.2 重组干酪乳杆菌的诱导表达  37-39
    3.2.1重组干酪乳杆菌的诱导表达鉴定结果  37-39
  3.3 免疫学指标的检测结果  39-47
    3.3.1 血清特异性 IgG 抗体的检测结果  39-40
    3.3.2 粪便中特异性 sIgA 抗体的检测结果  40
    3.3.3 外生殖道洗液中特异性 sIgA 抗体的检测结果  40-41
    3.3.4 鼻黏液中特异性 sIgA 抗体的检测结果  41
    3.3.5 眼睑洗液特异性抗体 IgA 抗体的测定  41-42
    3.3.6 脾淋巴细胞增殖试验结果  42-43
    3.3.7 抗体中和效价的检测结果  43-44
    3.3.8 Th 细胞亚类的检测  44-47
4 讨论  47-50
  4.1 干酪乳杆菌表达猪传染性胃肠炎病毒 S 蛋白 D 位点诱导免疫应答的研究  47-48
  4.2 胞壁酰二肽及促吞噬素增强特异性免疫应答水平的评价  48
  4.3 胞壁酰二肽和促吞噬素对免疫机制的调节作用  48-50
5 结论  50-51
致谢  51-52
参考文献  52-57
附录  57-64
攻读硕士学位期间发表的学术论文  64

TGEV S蛋白D位点和胞壁酰二肽及促吞噬素在干酪乳杆菌中的表达和免疫效果评价

内容摘要

全文目录

相似论文