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猪传染性胸膜肺炎杆菌菌影装载猪源巴氏杆菌外膜蛋白H基因疫苗的免疫效果评价

作　者: 徐良
导　师: 金天明
学　校: 天津农学院
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪传染性胸膜肺炎猪萎缩性鼻炎猪肺疫菌影基因疫苗
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

由猪传染性胸膜肺炎杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，App）引起的猪传染性胸膜肺炎（Porcine contagious pleuropneumonia，PCP）和多杀性巴氏杆菌（Pasteurellamultocide）引起的猪萎缩性鼻炎（Porcine infectious atrophic rhinitic，AR）以及猪肺疫（Swine plague）是猪场常见的呼吸道传染病，常呈混合感染。感染病猪呼吸道结构被破坏，容易受到其他呼吸道病原菌的感染，常给世界养猪业带来巨大的经济损失。因此，有必要开发一种联合疫苗对上述猪病进行预防。本研究利用A型猪源多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H成功构建了pCDNA-ompH基因疫苗，并将其装载到猪胸膜肺炎杆菌菌影中，制备了胸膜肺炎杆菌菌影装载pCDNA-ompH基因的二联疫苗，再通过小鼠攻毒试验评估其免疫保护效果，为该疫苗的临床应用奠定了实验基础。试验中将小鼠分成四组，其中三组分别用App菌影、pCDNA-ompH基因疫苗、App菌影装载pCDNA-ompH基因二联疫苗进行免疫接种，最后一组作为对照。共进行三次免疫，每次间隔2周，免疫一周后断尾采血，利用间接ELISA法检测抗体效价；最后一次免疫后2周用最小致死量活菌攻毒，观察一周，对于攻毒期间死亡小鼠进行剖检，采集心、肝、脾、肺、肾进行病理组织分析；一周后统计活鼠数量，解剖并观察病理变化，取血样本用于抗体测定，取心、肝、脾、肺、肾脏器用于病理组织分析。试验结果显示：App攻毒开始后小鼠出现食欲下降、精神沉郁、被毛粗糙、呼吸困难等现象，攻毒后App菌影疫苗免疫组死亡1只、App菌影疫苗装载pCDNA-ompH基因疫苗免疫组无死亡、对照组全部死亡，App菌影和App菌影装载pCDNA-ompH基因二联疫苗对最小致死量App I型活菌攻毒的保护率分别为90%和100%；Pm攻毒组小鼠出现食欲下降、被毛凌乱、腹泻、呼吸困难、反应迟缓等现象，攻毒后pCDNA-ompH基因疫苗免疫组死亡3只，App菌影装载pCDNA-ompH基因二联疫苗免疫组无死亡，对照组全部死亡，pCDNA-ompH基因疫苗和App菌影装载pCDNA-ompH基因二联疫苗对最小致死量Pm D型活菌攻毒的保护率分别为70%和90%。血清型A型多杀性巴氏杆菌的外膜蛋白H构建的基因疫苗，可以对血清型D型多杀性巴氏杆菌的攻毒产生交叉保护效力。病理切片分析可见App攻毒对照组的肺脏和肝脏淤血严重，肺部有凝固性坏死，菌影疫苗组和二联疫苗组存活小鼠则无明显病变或病变较轻；Pm攻毒对照组肾脏可见淤血、坏死、水泡变性，肺脏肺间质增宽和大面积淤血出血以及炎性细胞浸润等病变，攻毒存活的小鼠肾脏有轻微出血现象，肺部有轻微的淤血，其余各器官均正常。对比免疫前后和攻毒后小鼠，App菌影装载pCDNA-ompH二联疫苗组小鼠抗体滴度略高于App菌影组和pCDNA-ompH基因疫苗组，二联疫苗免疫的保护效果高于单一疫苗的免疫。本研究说明菌影装载基因疫苗构建二联疫苗的方法可行，已经取得的实验数据，可为进一步对猪传染性胸膜肺炎、猪萎缩性鼻炎以及猪肺疫的免疫保护奠定实验基础。

全文目录

Contents  8-10
摘要  10-11
Abstract  11-13
第一章引言  13-26
  1 前言  13
  2 研究背景  13-24
    2.1 猪传染性胸膜肺炎  13-19
      2.1.1 临床特征  14
      2.1.2 流行病学  14
      2.1.3 病原学  14
      2.1.4 致病因子  14-16
      2.1.5 猪胸膜肺炎检测方法  16-17
      2.1.6 猪传染性胸膜肺炎疫苗  17-19
    2.2 猪传染性萎缩性鼻炎  19-23
      2.2.1 病理变化  19
      2.2.2 流行病学  19-20
      2.2.3 病原学  20
      2.2.4 致病因子  20-21
      2.2.5 检测方法  21-22
      2.2.6 猪萎缩性鼻炎的疫苗  22-23
    2.3 猪肺疫及其疫苗  23-24
  3 目的与意义  24-26
第二章猪传染性胸膜肺炎杆菌菌影的鉴定以及猪源多杀性巴氏杆菌基因疫苗的制备  26-35
  1 材料和方法  26-32
    1.1 试验材料  26-27
      1.1.1 菌株和质粒  26
      1.1.2 主要培养基及其配制  26-27
      1.1.3 主要实验仪器  27
    1.2 方法  27-32
      1.2.1 App 菌影菌株的鉴定  27-29
      1.2.2 Pm ompH 基因疫苗的制备  29-32
  2 结果  32-33
    2.1 App 菌影菌株的 PCR 鉴定  32
    2.2 pCDNA-ompH 的制备  32-33
      2.2.1 ompH 的克隆  32
      2.2.2 pMD-ompH 克隆载体的构建  32-33
      2.2.3 ompH 的测序结果  33
      2.2.4 pCDNA-ompH 的构建  33
      2.2.5 pCDNA-ompH 的纯化  33
  3 讨论  33-34
  4 小结  34-35
第三章猪传染性胸膜肺炎杆菌菌影装载猪多杀性巴氏杆菌基因二联疫苗的免疫效果评价  35-51
  1 材料与方法  35-40
    1.1 试验材料  35-37
      1.1.1 主要培养基及其配制  35-36
      1.1.2 其它缓冲液及试剂  36
      1.1.3 细菌菌株  36
      1.1.4 试验动物  36
      1.1.5 仪器和耗材  36-37
    1.2 方法  37-40
      1.2.1 疫苗的无菌检验  37
      1.2.2 分光光度值与两种细菌浓度关系试验  37
      1.2.3 App I 型细菌 LD50和 Pm D 型细菌 LD50的确定  37
      1.2.4 最佳免疫剂量的确定  37
      1.2.5 疫苗的安全性实验  37-38
      1.2.6 间接 ELISA 法检测 App 抗体  38
      1.2.7 间接 ELISA 法检测 Pm 抗体  38
      1.2.8 小鼠疫苗试验分组  38
      1.2.9 免疫程序  38-39
      1.2.10 石蜡病理切片的制作  39-40
      1.2.11 免疫保护分析  40
  2 结果  40-48
    2.1 疫苗的无菌检验  40
    2.2 分光光度值与细菌计数试验  40-41
    2.3 App I 型和 Pm D 型对小鼠 LD50的测定  41-43
    2.4 间接 ELISA 法检测抗体效价  43-44
      2.4.1 包被浓度和血清的稀释度的确定  43-44
      2.4.2 酶标二抗工作浓度的确定  44
    2.5 免疫剂量的确定  44-45
    2.6 疫苗的安全性检验  45
    2.7 攻毒实验结果  45-46
    2.8 免疫与攻毒后小鼠血清 App、Pm 抗体水平  46-47
    2.9 剖检结果  47
    2.10 动物回归试验  47
    2.11 病理组织学变化  47-48
  3 讨论  48-49
  4 结论  49-51
参考文献  51-57
致谢  57-58
附录一  58-60
附录二  60-61
攻读学位期间发表的论文  61

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