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猪瘟病毒四种不同抗原卵黄抗体中和效力评价

作　者: 江馗语
导　师: 师东方
学　校: 东北农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪瘟病毒 E2基因 表位串联 卵黄抗体 生物学功能
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
下　载: 119次
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内容摘要


猪瘟(Classical Swine Fever, CSF)是由猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus, CSFV)引起的一种急性、接触性传染病。临床表现为高热和全身多发性小点出血,以内脏器官多发性出血、梗塞和坏死为主要病理特征。该病流行广泛,发病率和死亡率高,给养猪业造成了严重的经济损失。有人曾经用干扰素、中草药制剂来预防及治疗猪瘟,但均未取得成功。目前,对该病的预防主要采用免疫接种猪瘟兔化弱毒疫苗,但接种猪瘟疫苗后经常出现免疫失败的现象,不能对猪瘟进行全面有效的预防。卵黄抗体作为一种高效生物制剂在传染病的紧急预防中显示出了明显的效果,也为该病的紧急预防开辟了新的途径。本研究克隆了猪瘟病毒E2基因中抗原指数较高且含有中和性抗原域的A1/A2区以及B、C区中抗原性较高的一段区域,该区域位于E2基因上754～880氨基酸残基位置,命名为tE2,又合成了两段猪瘟病毒线性中和表位核苷酸序列,表位CKEDYRYAISSTNEIGLLGAGGLT位于E2基因上693～716氨基酸残基位置,命名为P1,表位QTAVSPTTLRTEVVK位于E2基因上828～842氨基酸残基位置,命名为P2。利用同尾酶串联技术将P1和P2两个中和表位分别在克隆载体pUC57上,重复串联4次,酶切后连接表达载体在大肠杆菌中表达,分别获得了具有中和抗原表位的tE2重组蛋白、4P1和4P2串联重组蛋白,经Western blot鉴定均具有抗原性。将上述3种重组蛋白和猪瘟活疫苗分别用白油佐剂混合乳化,分组免疫9月龄海兰蛋鸡,共进行3次免疫,每次间隔两周。其中,tE2重组蛋白免疫组的一免剂量为0.50mg/只,二免剂量为1.00mg/只,三免剂量为1.50mg/只；4P1和4P2串联重组蛋白免疫组一免剂量均为0.40mg/只,二免剂量为0.60mg/只,三免剂量为0.80mg/只；猪瘟活疫苗免疫组三次免疫的剂量均为10头份/只。二免后一周开始收蛋,用氯仿法抽提卵黄抗体,用建立的间接ELISA法检测抗体效价。以猪瘟活疫苗和tE2重组蛋白作为免疫原获得的卵黄抗体用tE2重组蛋白作为包被抗原,ELISA效价最高值分别为1:1024和1:4096；以4P1重组蛋白作为免疫原获得的卵黄抗体用4P1重组蛋白作为包被抗原,ELISA效价最高值为1:4096；以4P2重组蛋白作为免疫原获得的卵黄抗体用4P2重组蛋白作为包被抗原,ELISA效价最高值为1:1024。体外免疫荧光中和试验结果显示,抗猪瘟活疫苗卵黄抗体、抗tE2重组蛋白卵黄抗体、抗4P1重组蛋白卵黄抗体和抗4P2重组蛋白卵黄抗体均可不同程度中和猪瘟病毒。其中,抗猪瘟活疫苗卵黄抗体和J抗4P1重组蛋白卵黄抗体中和作用相对较强,抗体和病毒混合后接种PK-15细胞,培养24h和48h进行免疫荧光试验均无特异性荧光出现：而抗tE2重组蛋白卵黄抗体和抗4P2重组蛋白卵黄抗体和病毒混合后接入PK-15细胞,在24h和48h进行免疫荧光试验均有少量特异性荧光出现,但明显少于阳性接毒对照出现的荧光数量。兔体中和试验结果显示,抗猪瘟活疫苗卵黄抗体和抗4P1重组蛋白卵黄抗体能够延缓和降低兔体发热,说明对猪瘟病毒有一定的中和作用。本研究结果表明,以tE2、4P1、4P2重组蛋白和猪瘟活疫苗为免疫原制备的四种抗猪瘟病毒卵黄抗体,对猪瘟病毒均有不同程度中和作用。其中抗猪瘟活疫苗卵黄抗体和抗4P1重组蛋白卵黄抗体中和作用相对较强。该研究进一步证明了所选中和表位能够诱导机体产生中和抗体,在表位疫苗研究及有中和效力的卵黄抗体的制备上具有潜在的应用价值。

全文目录


摘要  8-10
Abstract  10-12
1. 引言  12-27
  1.1 猪瘟概述  12-13
  1.2 猪瘟病毒研究进展  13-19
    1.2.1 猪瘟病毒  13-14
    1.2.2 猪瘟病毒的基因组结构  14-15
    1.2.3 猪瘟病毒E2蛋白  15-19
  1.3 猪瘟的防治  19-21
    1.3.1 疫苗免疫  20
    1.3.2 中草药辅助治疗  20-21
    1.3.3 卵黄抗体防治  21
  1.4 卵黄抗体研究进展  21-26
    1.4.1 卵黄抗体的结构  22
    1.4.2 卵黄抗体的优缺点  22-24
    1.4.3 卵黄抗体的提取方法  24
    1.4.4 卵黄抗体的应用  24-26
  1.5 研究的目的与意义  26-27
2. 材料与方法  27-38
  2.1 实验材料  27-29
    2.1.1 毒株、菌株、质粒、实验动物及细胞系  27
    2.1.2 PCR扩增引物  27-28
    2.1.3 主要试剂  28
    2.1.4 主要仪器  28-29
  2.2 实验方法  29-38
    2.2.1 猪瘟病毒tE2基因的克隆及表达  29-31
    2.2.2 猪瘟病毒重复中和表位的串联及表达  31-34
    2.2.3 卵黄抗体的制备  34-35
    2.2.4 卵黄抗体效价ELISA检测  35-36
    2.2.5 卵黄抗体效力评价  36-38
3. 结果  38-65
  3.1 猪瘟病毒tE2基因的克隆及表达  38-48
    3.1.1 tE2基因片段的克隆  38
    3.1.2 tE2重组克隆质粒的PCR及酶切鉴定  38-39
    3.1.3 tE2重组表达质粒的PCR及酶切鉴定  39-42
    3.1.4 tE2重组蛋白的表达、纯化及Western blot鉴定  42-48
  3.2 猪瘟病毒重复中和表位的串联及表达  48-54
    3.2.1 人工合成质粒的鉴定  48-49
    3.2.2 串联重组克隆质粒的双酶切鉴定  49-50
    3.2.3 串联重组表达质粒的双酶切鉴定  50-51
    3.2.4 串联重组蛋白的表达、纯化及Western blot鉴定  51-54
  3.3 卵黄抗体效价检测  54-58
  3.4 卵黄抗体效力评价  58-65
    3.4.1 猪瘟病毒在猪肾细胞上的增殖培养鉴定  58-59
    3.4.2 卵黄抗体与猪瘟病毒的特异性结合荧光检查  59-60
    3.4.3 免疫荧光中和试验结果  60-64
    3.4.4 兔体中和试验结果  64-65
4. 讨论  65-69
  4.1 卵黄抗体在预防猪瘟方面的应用前景  65-66
  4.2 重复表位串联策略  66-67
  4.3 密码子偏好性对外源蛋白表达的影响  67
  4.4 不同免疫原制备的卵黄抗体效力比较  67-69
5. 结论  69-70
致谢  70-71
参考文献  71-80
攻读硕士学位期间发表的学术论文  80

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家畜 > 猪
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