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丛枝菌根真菌促进枳（Poncirus trifoliata L.Raf）磷吸收效应及其机理研究

作　者: 舒波
导　师: 夏仁学
学　校: 华中农业大学
专　业: 果树学
关键词: 枳 丛枝菌根真菌 磷吸收 磷转运子 植酸酶基因
分类号: S666.9
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


本课题从3个方面研究了丛枝菌根真菌(Arbuscular mycorrhial fungi, AMF)促进柑橘砧木枳(Poncirus trifoliata L. Raf)磷吸收的作用。首先试验基质不同无机磷水平条件下,丛枝菌根真菌种类间促进枳无机磷吸收、转运效应的差异；其次试验基质不同无机磷水平下,丛枝菌根真菌侵染对枳有机磷活化、利用的影响；最后比较枳对无机磷源和有机磷源的吸收效率,鉴定枳植酸酶基因。试验主要结果如下：(1)促进枳磷吸收的优势菌种。基质不同无机磷水平条件下,促进砧木枳磷吸收的优势菌种存在差异。施用1mM Hoagland营养液条件下,接种G. diaphanum和G. geosporum处理具有较高的枳实生苗干重、磷吸收量。施用1μM Hoagland营养液之后,接种G. versiforme处理对实生苗干重及磷吸收量有最强的促进作用。5种菌根真菌接种处理的枳根系总侵染率和丛枝侵染率对不同的磷处理表现出较一致的变化规律。施加1mM Hoagland营养液的处理条件下,接种G. diaphanum和G.geosporum处理枳根系有最高的总侵染率和丛枝侵染率,而所有施加1μM Hoagland营养液的处理中接种G. versiforme处理表现出最高的总侵染率和丛枝侵染率,且施加1μM Hoagland营养液显著的提高了枳实生苗根系总侵染率和丛枝侵染率。(2)枳Phtl磷转运子基因家族表达模式。枳Pht1基因家族至少含有7个成员,其在枳实生苗根系中的表达水平受菌根真菌侵染和土壤磷水平的调控。相对于未接种对照,菌根真菌的侵染使PtaPT1和PtaPT2的相对表达量降低了20%～80%, PtaPT3和PtaPT1的相对表达量降低了10%～30%；而PtaPT4和PtaPT5的相对表达水平为菌根真菌侵染所诱导,二者在枳实生苗根系中的相对表达量被丛枝菌根真菌侵染提高了50-800倍。低无机磷胁迫提高了除PtaPT6之外其它6个Pht1基因家族成员的相对表达量。在接种处理条件下,施加1μM Hoagland营养液的枳实生苗根系中PtaPT4和PtaPT5的相对表达量提高了30-350倍。(3)菌剂和有机磷处理对枳磷吸收量及基质磷浓度的影响。正常磷水平条件下,接种G. versiforme显著提高了枳实生苗的干重、磷吸收量,显著降低了基质有效磷浓度,而对枳实生苗磷浓度及基质有机磷浓度无显著的影响；植酸钙处理对枳实生苗的干重、磷浓度及磷吸收量无显著的影响；G. versiforme与植酸钙处理的相互作用对枳实生苗干重,磷浓度及磷吸收量无显著的影响。低无机磷胁迫条件下,接种G. versiforme显著提高了枳实生苗的干重、磷吸收量,显著降低了基质有效磷与有机磷的浓度；植酸钙处理同样显著提高了枳实生苗的干重、磷浓度、磷吸收量,且在基质有效磷浓度为4.04～5.57mg kg-1的范围内,提高了基质有效磷的浓度。(4)菌剂和有机磷处理对枳根系叶片及基质酶活性的影响。低无机磷胁迫条件下,接种G. versiforme显著提高了根系、土壤酸性磷酸酶和植酸酶活性,但降低了叶片酸性磷酸酶与植酸酶活性。植酸钙处理则降低了根系、叶片酸性磷酸酶与植酸酶的活性。G.versiforme处理、植酸钙处理及它们的互作效应对根系、叶片及土壤酸性磷酸酶和植酸酶活性的影响达到了显著和极显著水平。(5)菌剂和有机磷处理对枳根系叶片分泌酸性磷酸酶基因表达量的影响。正常磷水平条件下,G.versiforme的侵染降低了PtPAP1在根部的表达量,而其在叶中的表达量变化不明显。低无机磷胁迫条件下,G.versiforme的侵染显著提高了枳根系PtPAPl的表达量,植酸钙处理降低了枳实生苗根系PtPAPl的相对表达量。PtPAP2的表达水平相对稳定,其在叶片的表达水平受G.versiforme接种和植酸钙处理的影响微弱,其在根系中的表达水平变化也不明显。低无机磷胁迫显著提高了PtPAP3在根系中的转录水平,植酸钙处理降低了其表达水平,但菌根真菌的侵染对PtPAP3表达水平的影响不明显。(6)不同磷源对枳生长的影响。正常磷水平条件下,无机磷处理,有机磷处理及无磷处理对枳实生苗干重、磷浓度、磷吸收量无显著的影响。低无机磷胁迫条件下,无机磷处理枳实生苗磷浓度与磷吸收量显著高于有机磷处理枳实生苗,有机磷处理枳实生苗磷浓度与磷吸收量又显著高于无磷处理。此时,对比于正常磷水平处理,基质有机磷浓度显著降低,且有机磷处理提高了基质有效磷的浓度。低无机磷胁迫条件下,无机磷处理枳实生苗根系、叶片以及基质酸性磷酸酶与植酸酶活性都没有显著的变化,而无磷处理及有机磷处理枳实生苗酸性磷酸酶及植酸酶活性显著的提高,且无磷处理酶活性增强的程度高于有机磷处理。PtPAP1与PtPAP3的表达水平受磷处理影响显著,无磷处理枳根系中的表达水平高于有机磷处理,而有机磷处理又显著高于无机磷处理。PtPAP2在有机磷处理叶片中的相对表达量显著高于无机磷处理叶片。(7)枳植酸酶基因的鉴定。重组蛋白r.PtPAP3经去糖基化处理后分子量约为44.3～66kDa,与理论分子量相符。r-PtPAP3对pNPP的Km(1631μM)远大于其对植酸钠的Km(46.2μM).而从r-PtPAP3最大反应速率Vmax可知重组酶催化植酸的水解速度(214μmol min-1mg-1)小于其催化pNPP的水解速度(442μmol min-1mg-1).

全文目录


摘要  7-9
Abstract  9-11
缩略语表  11-13
第一章 前言  13-27
  1 课题的提出  13
  2 植物适应低磷胁迫的途径  13-20
    2.1 根系结构及其调控基因表达水平的变化  14-15
    2.2 磷转运子的诱导  15-17
    2.3 根系分泌物的释放  17-18
    2.4 与丛枝菌根真菌共生  18-19
    2.5 植物体内磷循环再利用  19-20
  3 丛枝菌根真菌的研究进展  20-25
    3.1 菌根的功能  20-23
      3.1.1 增强共生植物养分的吸收  20-21
      3.1.2 增强共生植物对生物胁迫的抗性  21-22
      3.1.3 增强共生植物对非生物胁迫的抗性  22-23
    3.2 丛枝菌根真菌的分子生物学研究  23-25
      3.2.1 确立共生关系的相关基因  23-24
      3.2.2 丛枝菌根真菌基因组  24-25
  4 丛枝菌根真菌侵染对共生植物适应低磷胁迫途径的影响  25-26
  5 研究目的和内容  26-27
第二章 丛枝菌根真菌对枳无机磷吸收的影响  27-46
  1 材料与方法  27-31
    1.1 试验材料  27
    1.2 试验设计  27-28
    1.3 试验方法  28-31
      1.3.1 枳实生苗生物量测定  28
      1.3.2 菌根侵染率测定  28
      1.3.3 枳实生苗磷浓度测定  28-29
      1.3.4 RNA提取及cDNA合成  29
      1.3.5 基因克隆及测序  29-31
      1.3.6 实时定量检测基因表达量  31
  2 试验结果  31-41
    2.1 菌剂与磷处理对枳实生苗干重及鲜重的影响  31-32
    2.2 菌剂与磷处理对枳实生苗磷浓度的影响  32
    2.3 菌剂与磷处理对枳实生苗磷吸收量的影响  32-37
    2.4 菌剂与磷处理对枳实生苗菌根侵染率的影响  37
    2.5 枳Pht1基因家族序列分析  37-39
    2.6 菌剂与磷处理对Pht1基因家族在实生苗根系中表达水平的影响  39-41
  3 讨论  41-46
    3.1 枳磷吸收优势菌种  41
    3.2 枳磷转运子Pht1基因家族的划分  41-42
    3.3 丛枝侵染率RLA与PtaPT4、PtaPT5表达量的联系  42-46
第三章 丛枝菌根真菌对枳有机磷吸收的影响  46-62
  1 材料与方法  46-48
    1.1 试验材料  46
    1.2 试验设计  46-47
    1.3 试验方法  47-48
      1.3.1 枳实生苗生物量测定  47
      1.3.2 枳实生苗磷浓度测定  47
      1.3.3 基质磷浓度测定  47
      1.3.4 基质酸性磷酸酶及植酸酶活性测定  47
      1.3.5 枳实生苗根系和叶片酸性磷酸酶及植酸酶活性测定  47-48
      1.3.6 枳分泌酸性磷酸酶基因的克隆  48
  2 试验结果  48-59
    2.1 菌剂与有机磷处理对枳实生苗干重、磷浓度和磷吸收量的影响  48-51
    2.2 有机磷处理对枳菌根侵染率的影响  51
    2.3 菌剂与有机磷处理对基质磷浓度的影响  51-54
    2.4 菌剂与有机磷处理对枳根系叶片基质酸性磷酸酶及植酸酶活性的影响  54-57
    2.5 菌剂与有机磷处理对枳分泌紫色酸性磷酸酶基因表达量的影响  57-59
  3 讨论  59-62
    3.1 地表球囊霉对枳实生苗植酸钙利用的影响  59
    3.2 地表球囊霉对枳实生苗植酸酶和酸性磷酸酶酶活性的影响  59-60
    3.3 地表球囊霉对枳实生苗酸性磷酸酶基因转录水平的影响  60-62
第四章 枳有机磷利用效率及植酸酶基因鉴定  62-81
  1 材料与方法  62-69
    1.1 试验材料  62
    1.2 试验设计  62-63
    1.3 试验方法  63-69
      1.3.1 枳实生苗生物量测定  63
      1.3.2 枳实生苗磷浓度测定  63
      1.3.3 基质磷浓度测定  63
      1.3.4 基质酸性磷酸酶及植酸酶活性测定  63
      1.3.5 枳实生苗根系、叶片酸性磷酸酶及植酸酶的测定  63
      1.3.6 不同磷处理对枳分泌磷酸酶基因表达量的影响  63
      1.3.7 分泌表达载体构建  63-65
      1.3.8 重组质粒转化酵母菌株  65-66
      1.3.9 重组蛋白诱导表达与鉴定  66
      1.3.10 重组蛋白的SDS凝胶电泳  66-67
      1.3.11 重组蛋白扩大表达与纯化  67
      1.3.12 重组蛋白的去糖基化  67
      1.3.13 重组蛋白的酶活性及参数的测定  67-68
      1.3.14 定磷法测定植酸酶酶活力  68-69
  2 试验结果  69-78
    2.1 磷处理对枳实生苗干重,磷浓度,磷吸收量及基质磷浓度的影响  69
    2.2 磷处理对枳根系叶片以及基质酸性磷酸酶及植酸酶活性的影响  69-70
    2.3 枳3个分泌磷酸酶基因功能预测  70
    2.4 磷处理对枳3个分泌磷酸酶基因表达量的影响  70-71
    2.5 重组蛋白r-PtPAP3活性及参数  71-78
  3 讨论  78-81
    3.1 不同磷处理对枳实生苗生长发育的影响  78-79
    3.2 枳植酸酶基因的鉴定  79-81
结论与展望  81-82
参考文献  82-102
附录Ⅰ 附表和附图  102-110
附录Ⅱ 课题资助项目  110
附录Ⅲ 论文撰写情况  110-111
致谢  111

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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 果树园艺 > 柑桔类 > 其他
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