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山葡萄高密度分子遗传图谱构建及抗寒性QTL定位研究

作　者: 刘镇东
导　师: 郭修武
学　校: 沈阳农业大学
专　业: 果树学
关键词: 葡萄遗传图谱抗寒性 QTL
分类号: S663.1
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

葡萄是我国重要的经济果树，近年来在常规杂交育种方面取得了可喜的进展，但在遗传图谱构建和分子标记辅助育种方面，明显落后于其他经济作物。本研究以欧亚种葡萄‘红地球’和山葡萄‘双优’杂交的94个F1代单株，以山欧杂种‘北冰红’自交的94个F2代单株为作图群体，采用SSR和SRAP两种分子标记技术分别构建了‘红地球’、‘双优’和‘北冰红’的分子遗传图谱，并对‘红地球’、‘双优’及其94个杂交后代，对‘北冰红’及其94个自交后代的抗寒性进行鉴定，最后用区间作图法对葡萄的抗寒性进行了QTL定位研究。葡萄高密度遗传图谱的构建和抗寒性的QTL定位，为今后抗寒基因的定位、克隆以及分子标记辅助育种提供了可靠的理论依据和方法材料，对提高葡萄抗寒育种水平具有重要意义。主要结果如下：1、成功地建立并优化了适宜山葡萄及其杂交后代的SRAP-PCR反应体系。5因素4水平正交试验结果表明：适宜山葡萄的20μl SRAP-PCR反应体系中各组分最适含量为DNA10ng，Primer0.8μmol·L^-1，dNTPs0.2mmol·L^-1，Mg2+3.2mmol·L^-1，Taq DNA聚合酶2.0U，并含2μl10×buffer（Mg2+free）。利用此反应体系，对24个‘红地球’×‘双优’杂交后代进行SRAP-PCR扩增，并电泳检测扩增效果，扩增谱带清晰且多态性较好，该体系可用于葡萄遗传图谱的构建及遗传多样性分析等相关研究。2、筛选出了447对葡萄SSR引物的最佳退火温度范围。筛选的温度分别为69℃、68.2℃、66.7℃、63.9℃、60.5℃、57.8℃、55.9℃、55℃。电泳检测结果表明，各引物在其最佳退火温度下都能扩增出清晰稳定的条带。3、利用优化了的SRAP-PCR反应体系成功地对‘红地球’×‘双优’的杂交后代进行了杂种的真实性鉴定。用筛选出的5对能够扩增出父本特异条带的SRAP引物对94株杂交后代进行了分析，结果表明：92.6%的杂交后代中出现了清晰、稳定的父本特异条带，结合田间形态学观察，确认为真杂种。4、利用筛选出的68对SRAP引物和186对SSR引物对‘红地球’×‘双优’杂交群体进行扩增，共获得347个SRAP分离位点和186个SSR分离位点。其中母本特有SRAP位点132个，只在母本上表现杂合的SSR位点48个；父本特有SRAP位点155个，只在父本上表现杂合的SSR位点54个；双亲共有SRAP位点60个，在双亲上都表现为杂合的SSR位点84个。利用筛选出的57对SRAP引物和174对SSR引物对‘北冰红’自交群体进行扩增，共获得279个SRAP分离位点和174个SSR分离位点。5、成功地构建了‘红地球’、‘双优’和‘北冰红’的分子遗传图谱。‘红地球’分子遗传图谱形成19个连锁群，包含266个位点，覆盖总图距1370cM，位点间平均距离为4.8cM；‘双优’分子遗传图谱形成20个连锁群，包含233个位点，覆盖总图距为1254cM，位点之间平均距离为5.0cM；‘北冰红’分子遗传图谱形成21个连锁群，包含228个位点，覆盖总图距为1123cM，位点之间平均距离为4.5cM。6、鉴定了‘红地球’、‘双优’及其杂交群体的94个单株，‘北冰红’及其自交群体的94个单株的抗寒性。对所有试材的一年生成熟枝条进行低温梯度处理（-15℃、-20℃、-25℃、-30℃、-35℃、-40℃和-45℃），测定了各处理温度下枝条的相对电导率，并与Logistic方程拟合，计算出各亲本及后代单株的半致死温度（LT50），以半致死温度衡量试材的抗寒性。在此基础上，成功地对葡萄抗寒性进行了初步的QTL定位。在‘双优’遗传图谱中检测到1个控制抗寒性的QTL位点，在‘北冰红’遗传图谱中检测到1个控制抗寒性的QTL位点，在‘红地球’遗传图谱中共检测到4个控制抗寒性的QTL位点。

全文目录

摘要  10-12
Abstract  12-14
缩略词  14-15
第一章文献综述  15-28
  1.1 分子标记概述  15-18
    1.1.1 RFLP  15-16
    1.1.2 RAPD  16
    1.1.3 SSR  16
    1.1.4 ISSR  16-17
    1.1.5 AFLP  17
    1.1.6 SRAP  17-18
    1.1.7 SNP  18
  1.2 遗传图谱  18-22
    1.2.1 构建遗传图谱的理论依据  18
    1.2.2 构建遗传图谱的主要步骤  18-20
    1.2.3 果树遗传图谱构建研究进展  20-22
  1.3 QTL 定位  22-24
    1.3.1 QTL 定位的原理和方法  22-23
    1.3.2 果树 QTL 定位研究进展  23-24
  1.4 葡萄抗寒性遗传育种研究进展  24-27
    1.4.1 葡萄抗寒性遗传研究进展  24-25
    1.4.2 葡萄抗寒育种研究进展  25-27
  1.5 本研究的目的意义  27-28
第二章葡萄作图群体的创建  28-34
  2.1 材料与方法  28-30
    2.1.1 创建群体选用的亲本材料  28
    2.1.2 DNA 提取和质量检测  28-29
    2.1.3 RS 群体的杂种真实性鉴定  29-30
  2.2 结果与分析  30-32
    2.2.1 DNA 的提取和质量检测  30-31
    2.2.2 RS 群体的杂种鉴定  31-32
  2.3 讨论  32-33
    2.3.1 关于作图群体的亲本选择  32-33
    2.3.2 关于杂种鉴定  33
  2.4 小结  33-34
第三章葡萄 SRAP 和 SSR 分子标记体系的优化  34-44
  3.1 材料与方法  34-37
    3.1.1 材料  34-35
    3.1.2 方法  35-37
  3.2 结果与分析  37-41
    3.2.1 多因素组合对 SRAP-PCR 的影响  37
    3.2.2 SRAP-PCR 反应体系的验证  37-38
    3.2.3 退火温度对 SSR 反应的影响  38-41
  3.3 讨论  41-42
  3.4 小结  42-44
第四章葡萄分子遗传连锁图谱的构建  44-80
  4.1 材料与方法  44-47
    4.1.1 试验材料  44
    4.1.2 试验方法  44-47
  4.2 结果与分析  47-76
    4.2.1 作图群体的 SRAP 分析结果  47-54
    4.2.2 作图群体的 SSR 分析结果  54-61
    4.2.3 分子遗传图谱的构建  61-76
  4.3 讨论  76-79
    4.3.1 关于 SSR 标记在‘红地球’和‘双优’杂交群体中分离情况与其在构图中的利用  76-77
    4.3.2 关于 SSR 标记的杂合率  77
    4.3.3 关于标记的偏分离  77-78
    4.3.4 关于新增的 SRAP 标记和图谱的质量  78-79
  4.4 小结  79-80
第五章葡萄抗寒性的 QTL 定位  80-94
  5.1 材料与方法  80-81
    5.1.1 材料  80
    5.1.2 抗寒性的表型鉴定  80-81
  5.2 结果与分析  81-92
    5.2.1 作图群体抗寒性鉴定结果  81-87
    5.2.2 抗寒性表型值在两个群体中的次数分布  87-88
    5.2.3 抗寒性 QTL 定位分析  88-92
  5.3 讨论  92
    5.3.1 关于 QTL 定位  92
    5.3.2 关于 QTL 在分子辅助育种中应用  92
  5.4 小结  92-94
第六章结论与创新点  94-96
  6.1 主要结论  94-95
  6.2 创新点  95
  6.3 下一步研究设想  95-96
参考文献  96-107
致谢  107-108
攻读学位期间发表的论文  108-109

山葡萄高密度分子遗传图谱构建及抗寒性QTL定位研究

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