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桃花芽休眠解除SSH文库构建及相关基因的功能分析

作　者: 李玲
导　师: 高东升
学　校: 山东农业大学
专　业: 果树学
关键词: 油桃花芽休眠解除抑制性差减杂交
分类号: S662.1
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

本实验于2008年8月～2010年12月在山东农业大学果树试验站、园艺科学与工程学院中心实验室进行。分别以十年生大田‘曙光油桃’和3年生盆栽‘曙光油桃’花芽为试材分离芽休眠解除的相关基因，研究其分子功能，并研究相关基因在低温、短日照、激素处理条件下对休眠解除的影响。对于揭示芽自然休眠机理，人为调控花期，具有重要的理论意义和实践价值。主要结果如下：利用抑制性差减杂交（SSH）技术，以休眠解除芽的RNA为‘Tester’，休眠芽的RNA为‘Driver’，构建花芽休眠解除相关基因的差减cDNA文库，共测定分析了180个上调表达的cDNA片段，测序成功128个，除去冗余序列，筛选到28个与自然休眠解除相关的差异基因，根据blast分析结果，进行分子功能预测，结果发现：以防御功能蛋白及新陈代谢类占的比例最大，分别达到25%和17.86%；其次是氧化还原与信号转导类，分别达到14.29%和7.14%，另外结构功能活性基因、功能未知蛋白、没有匹配蛋白、转运活性蛋白基因等占35.71%。根据候选基因的功能推测和前人关于植物休眠调控的研究结果，选取了8个可能与自然休眠解除相关的基因PpMt，PpDhn，PpHis，PpPod，PpSenescence-associatedprotein，PpCyp450，PpATP-binding cassette transporter protein和unknown，采用qRT-PCR技术分析发现：它们在花芽自然休眠解除期间上调表达，认为曙光油桃花芽自然休眠解除的过程伴随着复杂物质代谢和能量消耗，差异基因主要参与植物生长发育及抗性胁迫等方面的调控，而且低温诱导的核糖体蛋白的表达可能也与花芽自然休眠解除有关。PpDfn、PpDhn是文库中筛选到的全长cDNA序列，PpDfn、PpDhn基因编码的蛋白质氨基酸序列与其他物种的防御素蛋白（DFN、DHN）的氨基酸序列同源性较高。对二者进行蛋白质信号肽、跨膜结构域及疏水性分析，结果显示：PpDFN蛋白有1个信号肽，为分泌性蛋白。存在1个跨膜区，属于疏水性蛋白。通过对其氨基酸序列的进化树分析，发现与葡萄、油橄榄亲缘关系最近。PpDHN蛋白没有信号肽，无跨膜结构域，属于亲水性蛋白。通过对其氨基酸序列的进化树分析，发现与杏亲缘关系最近，二者聚在一起。采用qRT-PCR技术进一步分析了PpDFN、PpDHN在自然休眠解除期间、低温及短日照处理条件下的表达模式变化，发现PpDfn、PpDhn随自然休眠解除、低温处理时间的延长，基因表达量逐渐增加，冷处理2周时达到最高值；短日照处理后则没有明显变化。推测PpDfn基因随休眠解除及低温处理的上调表达，可能是参与了乙烯信号途径而诱导表达的结果。PpDhn基因随休眠解除及低温处理的上调表达可能与抗冻、清除自由基、保护生物膜免受伤害有关。在油桃休眠及休眠解除期间，曙光油桃PIP1;1的转录水平呈现持续增高趋势，且1月15日的高水平表达使水分通过液泡膜和细胞质膜流出，减少了芽体水分含量，阻止细胞内冰晶的形成，从而抵御冻害；可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸含量均达到最高，防止细胞的脱水伤害。低温处理2周后高水平表达说明PIP1;1为冷诱导基因。δTIP1的转录水平在休眠期间呈现波动性变化，至休眠解除时大幅度增高，这可能与休眠解除时，其上调表达被休眠解除信号及植物活性的增强所诱导有关。低温处理2周后，其表达没有升高，说明δTIP1并非冷诱导基因。在曙光油桃休眠及休眠解除期间，深休眠期(11月15日)和休眠后期(12月15日)，喷布GA3和6-BA研究激素对解除休眠的效果。结果发现：在休眠后期施用GA3和6-BA能不同程度的提高H2O2含量和POD、SOD基因的表达量，降低CAT基因的表达水平。对萌芽率的统计表明，深休眠期施用GA3和6-BA对油桃花芽破眠无效，处理15天后没有花芽萌发。休眠后期施用GA3和6-BA破眠效果较为明显，萌芽较对照提前8d和3d，最终萌芽率达98%、91%，分别比对照提高了37%和30%。GA3的破眠效果好于6-BA。

全文目录

符号缩写及中英文对照  4-10
中文摘要  10-12
Abstract  12-14
1 引言  14-42
  1.1 植物芽休眠调控机理的研究进展  14-32
    1.1.1 芽休眠概述  14-15
    1.1.2 芽休眠的发展进程  15-17
    1.1.3 休眠发展进程的界定  17-18
    1.1.4 芽休眠的诱导  18-21
    1.1.5 芽休眠的解除  21-23
    1.1.6 休眠及解除期间芽的某些重要生理生化变化  23-25
    1.1.7 休眠及休眠解除期间芽的分子调控机制  25-32
  1.2 差异表达基因的筛选方法  32-35
    1.2.1 mRNA 差异显示技术  32-33
    1.2.2 RNA 随机引物聚合酶链式反应  33
    1.2.3 代表性差示分析  33-34
    1.2.4 基因表达的序列分析  34
    1.2.5 抑制差减杂交  34-35
    1.2.6 基因芯片技术  35
  1.3 本研究采用的抑制性差减杂交（SSH）  35-40
    1.3.1 SSH 技术流程  35-38
    1.3.2 抑制性差减杂交技术在分离植物差异表达基因中的作用  38-40
  1.4 研究目的与意义  40-41
  1.5 本项研究的技术路线  41-42
2 实验材料与方法  42-59
  2.1 实验材料  42-43
    2.1.1 实验材料与处理  42
    2.1.2 花芽处理  42-43
    2.1.3 质粒及菌种  43
    2.1.4 试剂盒、生化试剂等  43
    2.1.5 仪器与设备  43
    2.1.6 PCR 引物合成与测序  43
  2.2 实验方法  43-58
    2.2.1 桃树花芽休眠解除相关基因的分离  43-55
    2.2.2 桃树花芽自然休眠解除过程中差异基因的表达模式分析  55-56
    2.2.3 防御蛋白及脱水蛋白基因在休眠解除过程中的功能分析  56
    2.2.4 水孔蛋白基因在休眠及休眠解除过程中的功能分析  56-57
    2.2.5 休眠及休眠解除期间过氧化氢相关酶基因的表达分析及 GA、6-BA 对休眠解除的影响  57-58
  2.3 数据处理  58-59
3 结果与分析  59-86
  3.1 桃树花芽休眠解除相关基因的分离  59-64
    3.1.1 桃树花芽自然休眠时期的确定  59
    3.1.2 CTAB 法提取的总 RNA 完整性、纯度检测  59-60
    3.1.3 桃花芽 cDNA 差减文库构建及上调表达的 cDNA 阳性克隆的筛选  60-62
    3.1.4 桃树花芽内休眠解除相关基因的 Blast 分析及功能分类  62-64
  3.2 桃树花芽自然休眠解除过程中差异基因的表达模式分析  64-67
    3.2.1 不同时期桃树花芽总 RNA 的提取  64-65
    3.2.2 花芽自然休眠解除过程中差异基因表达模式的 RT-PCR 分析  65-67
  3.3 防御蛋白及脱水蛋白基因在休眠解除过程中的功能分析  67-79
    3.3.1 防御蛋白基因的生物信息学分析  67-72
    3.3.2 脱水蛋白基因的生物信息学分析  72-78
    3.3.3 休眠及休眠解除期曙光油桃花芽 dfn、dhn 基因的转录分析  78
    3.3.4 不同处理条件下防御蛋白、脱水蛋白基因的 RT-PCR 分析  78-79
  3.4 水孔蛋白基因在休眠解除过程中的功能分析  79-82
    3.4.1 休眠解除期间水孔蛋白基因的表达分析  79-80
    3.4.2 桃花芽可溶性糖含量的变化  80
    3.4.3 桃花芽含水量的变化  80-81
    3.4.4 曙光油桃可溶性蛋白和脯氨酸含量的变化  81
    3.4.5 低温条件下曙光油桃花芽 AQPs 基因的转录分析  81-82
  3.5 休眠解除期间过氧化氢相关酶基因的表达分析  82-86
    3.5.1 休眠解除期间过氧化氢含量的测定  82
    3.5.2 休眠及休眠解除期间 SOD、CAT、POD 的表达分析  82-83
    3.5.3 GA_3、6-BA 对过氧化氢含量的影响  83-84
    3.5.4 GA_3、6-BA 处理条件下 CAT、POD、SOD 的表达分析  84-85
    3.5.5 GA_3、6-BA 处理对休眠解除的影响  85-86
4. 讨论  86-95
  4.1 桃树花芽休眠解除相关基因的分离  86-87
    4.1.1 桃树花芽总 RNA 的提取  86
    4.1.2 差减 cDNA 文库的筛选及差异基因冗余性  86-87
    4.1.3 休眠解除相关基因涉及生命活动的多个方面  87
    4.1.4 低温诱导的核糖体蛋白的表达可能与花芽内休眠的解除有关  87
  4.2 桃树花芽自然休眠解除过程中差异基因的表达模式分析  87-90
    4.2.1 HisH3、Dhn 和 MT 基因的表达模式分析  87-88
    4.2.2 PpPod，PpSenescence-associated protein，PpATP-binding cassette transporter protein 基因的表达模式  88-89
    4.2.3 生长素结合蛋白基因 PpABP20、PpCyp450 的表达模式  89-90
  4.3 防御素蛋白与脱水蛋白基因在休眠解除过程中的功能分析  90-92
    4.3.1 生物信息学技术在基因功能研究中的应用  90
    4.3.2 不同条件下防御素蛋白基因与脱水蛋白基因在休眠解除过程中的表达分析  90-92
  4.4 水孔蛋白基因在休眠解除过程中的功能分析  92-93
    4.4.1 休眠解除期间桃花芽中渗透调节物质的变化  92
    4.4.2 休眠解除期间桃花芽中 AQPs 基因的变化  92-93
  4.5 休眠解除期间过氧化氢相关酶基因的表达分析  93-95
    4.5.1 GA_3、6-BA 打破油桃休眠的效应  93-94
    4.5.2 GA_3、6-BA 解除曙光油桃花芽休眠的生理机制探讨  94-95
5 结论及研究展望  95-98
  5.1 结论  95-96
  5.2 研究展望  96-98
参考文献  98-116
附录  116-118
致谢  118-119
攻读博士学位期间发表和已接受论文  119

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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 果树园艺 > 核果类 > 桃
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