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长期豆科绿肥轮作水稻根内生细菌多样性及促生功能研究

作　者: 曹艳花
导　师: 徐凤花
学　校: 东北农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 长期豆科绿肥轮作 水稻根 内生细菌 促生功能 16S rDNA克隆文库 细菌群落多样性
分类号: S55
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


大量研究证实,绿肥是保持和提高土壤肥力和质量的有效措施之一,虽然已有绿肥对土壤微生物影响的相关研究报道,但由于所用方法和技术所限,相关研究既不系统也不深入,特别是绿肥对水稻根内生细菌影响研究尚属空白。本课题以湖南祁阳农田系统国家野外科学观测研究站具有28年(1982-2010)长期定位历史的稻-稻-紫云英豆科绿肥及稻-稻-冬闲轮作水稻根为材料,采用基于16S rDNA为基础的先进分子生态学方法与传统培养方法相结合,深入系统研究紫云英绿肥轮作水稻根内生微生物多样性。本研究同时将针对性地分离培养微生物类群,对可培养微生物溶磷性,产植物生长素(IAA),产铁载体,拮抗及固氮酶活性等促生功能研究。通过培养方法检测水稻根内生微生物数量,结果表明：稻-稻-紫云英绿肥轮作系统水稻根中微生物平均数量为7.75×106cfu·g-1鲜土,比稻-稻-冬闲高78.17%。通过传统细菌分离培养方法从稻-稻-冬闲和稻-稻-紫云英水稻根中分别分离77株和169株细菌。对246株细菌溶磷、分泌生长素(IAA)及分泌铁载体的功能进行了初步测定,结果表明稻-稻-紫云英内生细菌具有溶解无机磷活性、溶解有机磷活性、分泌生长素(IAA)能力及产铁载体能力菌株分别为139、12、72、73株,稻-稻-冬闲分别为67、8、40、57株。其中菌株ZYY43的溶磷活性最高；菌株ZYY170产IAA能力最高,为419.17ug/mL;菌株DX78分泌铁载体能力最强,达到了“++++”的水平。在上述研究基础上选取48株菌进行拮抗试验,结果显示,3株菌对棉花红腐病菌(Fusarium moniliforme ACCC36127)有抑制作用,其中的2株对水稻白叶枯病菌(Xanthomonas campestris pv.oryzae ACCC05509)有抑制作用。固氮酶活性检测结果发现,菌株DX35的固氮酶活性最高为181.21nmolC2H4/mg protein hr,为参比菌株圆褐固氮菌(Azotobacter chroococcum ACCC10006)的10倍左右,在固氮菌肥开发方面具有非常大的应用潜力。并在此基础上利用大试管和盆栽水稻促生试验的方法筛选10株兼具多种促生功能的优良菌株,菌株ZYY5、ZYY10和ZYY136准备进行田间试验。采用传统的分离培养方法结合分子生物学技术对稻-稻-紫云英和稻-稻-冬闲水稻根内生可培养细菌群落多样性进行研究。用限制性内切酶HaeⅢ和RsaⅠ联合酶切,获得246株菌酶切指纹图谱。结果表明,HaeⅢ和RsaⅠ联合酶切产生了23个基因分型,单一酶切产生的基因分型少。16S rDNA系统发育分析结果表明,分离得到的77株稻-稻冬闲细菌分属14属15个种,分离得到的169株稻-稻紫云英细菌分属19属21个种。两个样品中细菌群落大多数为变形菌纲(Proteobacteria)。其中β-变形菌纲(β-proteobacteria)占据优势地位,其次为γ-变形菌纲(γ-proteobacteria),其他分属α-变形菌纲(α-proteobacteria)及厚壁菌门(Firmicutes)。放线菌门(Actinobacteria)只存在于稻-稻-紫云英水稻根内生可培养细菌中。其中Herbaspirillum和Cedecea为两个处理中分离到的共有优势种群,而稻-稻-紫云英水稻根内生细菌中的伯克霍尔德氏菌(Burkholderia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)和泛菌属(Pantoea)也为分离到的优势种群,且在稻-稻-紫云英水稻根这一特殊的生存空间中有1株潜在的根瘤菌属(Rhizobium)新种存在。可培养的细菌中,编号为ZYY136菌株其16S rDNA基因序列在NCBI Blast中比对发现与根瘤菌属(Rhizobium)的Rhizobium alkalisoli (CCBAU01393)的同源性最高,为96.174%。以近缘菌株CCBAU01393(Rhizobium alkalisoli)和SO2(Rhizobium huautlense)为参比菌株,采用多相分类方法,对其形态学特征、唯一碳氮源利用、脂肪酸组成成分分析(MIDI)、 ERIC-PCR和BOX-PCR指纹图谱分析、16S rDNA全序列分析及atpD、gltA、gyrB、recA、 rpoB、thrC持家基因序列的系统发育进行分析。实验结果初步证实,ZYY136菌株为根瘤菌属(Rhizobium)的一个新种。利用细菌通用引物,对从2个水稻根样品中提取总DNA进行16S rDNA基因的PCR扩增,构建克隆文库对PCR产物进行分析,结果显示,2个水稻根样品中细菌群落大多数为变形菌纲(Proteobacteria)。其中β-变形菌纲(β-proteobacteria)占据优势地位,其次为α-变形菌纲(α-proteobacteria)和δ-变形菌纲(δ-proteobacteria),其他分属及厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和放线菌门(Acidobacteria)等,但在所占比例上有较大区别。且(Armatimonadetes)在稻-稻-冬闲模式(DX)水稻根中存在,而稻-稻-紫云英豆科绿肥还田(ZYY)处理中没有被发现。其中伯克霍尔德氏菌(Burkholderia)和根瘤菌(Bradyrhizobium)为两个处理中分离到的共有优势种群,而其数量在稻-稻-紫云英水稻根内分布较高。纯培养方法从稻-稻-冬闲和稻-稻-紫云英水稻根样品中得到的细菌群落与克隆文库构建检测到的群落多样性相比,均发现2个水稻根样品中细菌群落大多数为变形菌纲(Proteobacteria)。利用可培养和非培养方法对分离的根内生细菌的物种多样性分析均表明：长期稻-稻-紫云英豆科绿肥轮作水稻根内生细菌物种丰富度指数、多样性指数、均匀度指数、优势度指数的值均较稻-稻-冬闲水稻根内生细菌高,证明豆科绿肥还田内生细菌多样性较为丰富,且首次在稻-稻-紫云英豆科绿肥轮作水稻根中发现古菌存在。

全文目录


摘要  8-10
Abstract  10-13
1 前言  13-26
  1.1 绿肥还田研究进展  13
  1.2 植物根际和根内生细菌研究概述  13-14
  1.3 植物内生微生物研究方法  14-15
    1.3.1 传统可培养(Culture-dependent)方法  14-15
    1.3.2 非培养(Culture-independent)方法  15
  1.4 植物内生细菌促生功能多样性  15-18
    1.4.1 直接促使植物生长功能  16
    1.4.2 对病原菌的拮抗功能  16-17
    1.4.3 固氮功能  17-18
  1.5 生物多样性研究  18-22
    1.5.1 生物多样性的概念  18
    1.5.2 表型多样性和分类  18-20
    1.5.3 遗传多样性研究  20-22
  1.6 研究目的与意义  22-24
  1.7 技术路线  24
  1.8 特色与创新  24-26
2 材料与方法  26-42
  2.1 试验材料  26-30
    2.1.1 样品采集地点描述  26
    2.1.2 水稻根样品采集  26
    2.1.3 培养基  26-28
    2.1.4 酶、试剂及参比菌株  28-29
    2.1.5 盆栽材料  29
    2.1.6 分析软件  29
    2.1.7 仪器设备  29-30
  2.2 试验方法  30-42
    2.2.1 水稻根表面灭菌  30
    2.2.2 内生细菌数量测定及菌株分离  30
    2.2.3 可培养功能菌株初筛  30-31
    2.2.4 功能菌株复筛  31-32
    2.2.5 功能菌株促生实验  32-33
    2.2.6 可培养内生细菌的DNA提取  33
    2.2.7 可培养内生细菌16S rDNA片段PCR扩增  33-34
    2.2.8 扩增片段的限制性酶切ARDRA分型  34
    2.2.9 可培养内生细菌多样性分析  34
    2.2.10 可培养菌株16S rDNA鉴定及系统发育分析  34-35
    2.2.11 新类群ZYY136菌株鉴定  35-38
    2.2.12 水稻根基因组DNA的提取和纯化  38
    2.2.13 水稻根内生细菌16S rDNA的PCR扩增及PCR产物纯化  38-39
    2.2.14 内生细菌16S rDNA克隆文库构建  39-40
    2.2.15 内生古菌PCR扩增及克隆文库构建  40-42
3 结果与分析  42-78
  3.1 水稻根内生细菌数量分布状况  42
  3.2 促生功能菌株初筛  42-47
    3.2.1 溶磷能力测定  42-43
    3.2.2 产铁载体能力测定  43-44
    3.2.3 分泌植物生长激素能力测定  44-47
  3.3 促生功能菌株复筛  47-51
    3.3.1 对病原菌的拮抗作用  47-48
    3.3.2 固氮酶活性测定  48-51
    3.3.3 功能菌株筛选结果  51
  3.4 功能菌株促生能力评价  51-52
    3.4.1 大试管及盆栽水稻促生能力评价  51-52
    3.4.2 与紫云英豆科植物结瘤试验  52
  3.5 可培养内生细菌DNA的提取和16S rDNA片段PCR扩增  52
  3.6 扩增片段的ARDRA酶切分型分析  52-54
  3.7 可培养细菌群落多样性分析  54
  3.8 可培养菌株序列测定与系统发育分析  54-58
  3.9 根瘤菌属新种ZYY136的描述  58-68
    3.9.1 菌株ZYY136的形态特征  58
    3.9.2 菌株ZYY136唯一碳、氮源利用  58-60
    3.9.3 菌株ZYY136全细胞脂肪酸成分分析  60
    3.9.4 ZYY136菌株ERIC-PCR指纹图谱分析  60-61
    3.9.5 ZYY136菌株BOX-PCR指纹图谱分析  61-62
    3.9.6 菌株ZYY136的16S rDNA全序列同源性分析  62-63
    3.9.7 菌株ZYY136持家基因序列分析  63-68
    3.9.8 菌株ZYY136鉴定结果  68
  3.10 水稻根总DNA的提取  68-69
  3.11 内生细菌16S rDNA片段的PCR扩增  69-70
  3.12 内生细菌16S rDNA克隆文库构建及序列分析  70-71
  3.13 内生细菌16S rDNA克隆文库的评价  71-75
    3.13.1 Coverage C值及rarefaction curve  71
    3.13.2 水稻根内生细菌多样性比较分析  71-72
    3.13.3 水稻根内生细菌群落系统发育学比较分析  72-75
  3.14 可培养和非培养方法水稻根内生细菌菌群数量比较分析  75-76
    3.14.1 纲水平菌群比较分析  75
    3.14.2 优势种属比较分析  75-76
  3.15 内生古菌克隆文库构建及序列分析  76-78
    3.15.1 内生古菌的PCR扩增  76
    3.15.2 内生古菌克隆文库构建及系统发育分析  76-78
4 讨论  78-80
5 结论  80-82
致谢  82-83
参考文献  83-89
附录  89-105
攻读硕士学位期间发表的学术论文  105

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 绿肥作物
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