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禾谷丝核菌拮抗细菌RB5的分离鉴定及其抑菌活性研究

作　者: 时玉
导　师: 吴兴泉; 伊艳杰
学　校: 河南工业大学
专　业: 微生物学
关键词: 禾谷丝核菌拮抗细菌RB5 分离鉴定发酵条件抗菌机理
分类号: S476.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

禾谷丝核菌侵染引起的小麦纹枯病极大的影响了小麦的产量。随着化学农药的大量使用，土地盐碱化以及环境的破坏已日趋严重，开发出既能防治病虫害，又不污染破坏环境的药物已迫在眉睫，土壤中含有大量的有益微生物，其代谢产物能有效防治病虫害并促进植物生长。本研究从小麦根际土壤中，筛选对禾谷丝核菌有较高拮抗作用的菌株，并对其进行了种属鉴定和抑菌活性研究，为小麦纹枯病的有效防治和生防杀菌剂的开发奠定了基础。从小麦根际土壤中共分离纯化了158株细菌，经平板对峙实验反复筛选后发现有7株细菌抑菌效果较好。其中RB5的抑菌能力最强，抑制率高达78.6%。发酵液的抑菌活性达58.2%。根据形态学特征、生理生化特性测定和16S rDNA序列分析将拮抗细菌RB5鉴定为荧光假单胞菌（Pseudomonas sp.）。通过显微镜观察经拮抗菌发酵液处理过的禾谷丝核菌菌丝，发现菌丝发生明显的弯曲和断裂。测定经发酵液处理过的菌丝产生的三种胞壁降解酶的活性，其活性都较对照组显著下降。当RB5发酵液浓度为100%时对多聚半乳糖醛酸酶(PG)、果胶甲基半乳糖醛酸酶(PMG)和果胶甲基反式消除酶(PMTE)三种酶的活性抑制率最大，分别为87.83%、97.98%和94.68%。为提高拮抗细菌RB5发酵产物的抑菌活性，进行了C源和N源的单因素条件优化，实验结果表明，甘油作为C源，酵母膏作为N源有很高的抑菌效果。为降低实验生产成本且保证RB5菌株的的生防作用，使用价格较低且营养成分较高豆粕作为N源，木薯作为C源作为培养基主要成分，设计PB实验，从七因素中找出了影响实验的显著因素，分别为C源，N源和转速。以上述三个因素设计响应面实验，实验后抑菌效果最好达到82%。通过方差分析，计算出最优试验条件为C源87%、N源52%、转速218r/min。通过验证得出抑制率平均值为79.06%，与理论值相差8％。表明此条件合理且效果明显。为明确拮抗细菌RB5发酵液的活性成分，进行了嗜铁素、蛋白酶、几丁质酶等代谢产物的检测，检测结果都为阳性，证明发酵液中含有这些代谢产物。同时进行了一些代谢物质的分子方法检测，结果发现RB5含有与吡咯菌素（PRN）的产生相关基因Prnd。为进一步验证RB5菌株处理发酵液的实际效用，进行了室内防效盆栽实验，室内防效最高达到了36%。证明了RB5有很好的抵抗禾谷丝核菌的能力。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-13
第一章前言  13-22
  1.1 小麦纹枯病  13
  1.2 小麦纹枯病的病原菌研究  13-14
  1.3 小麦纹枯病的防治技术  14
  1.4 病原菌的微生物防治  14-16
  1.5 生防细菌及其作用机制  16-17
  1.6 禾谷丝核菌拮抗菌的研究进展  17-18
  1.7 荧光假单胞菌的研究现状  18-19
  1.8 研究目的及意义  19-20
  1.9 主要研究内容和技术路线  20-22
第二章拮抗细菌的筛选和鉴定  22-32
  2.1 试验材料  22-24
    2.1.1 病原菌  22
    2.1.2 土样  22
    2.1.3 培养基  22
    2.1.4 PCR 引物  22
    2.1.5 试剂和仪器  22-24
  2.2 试验方法  24-27
    2.2.1 土样的采集  24
    2.2.2 病原菌的培养  24
    2.2.3 拮抗细菌的初筛  24
    2.2.4 生防细菌的复筛  24-25
    2.2.5 生防细菌的生理生化特性鉴定  25
    2.2.6 细菌基因组的提取  25
    2.2.7 16SrDNA 序列的 PCR 扩增  25-26
    2.2.8 目的片段回收  26
    2.2.9 感受态细胞的制备  26
    2.2.10 连接  26
    2.2.11 转化  26
    2.2.12 菌落 PCR  26-27
    2.2.13 基因测序与分析  27
  2.3 结果与分析  27-30
    2.3.1 土壤中细菌的分离纯化  27
    2.3.2 土壤中细菌的初筛  27
    2.3.3 拮抗细菌的复筛  27-28
    2.3.4 拮抗细菌 RB5 的形态特征  28
    2.3.5 拮抗细菌 RB5 的生理生化特性  28-29
    2.3.6 16Sr DNA 序列扩增  29
    2.3.7 系统发育树构建  29-30
  2.4 讨论  30-32
第三章拮抗细菌 RB5 的抗菌机理研究  32-43
  3.1 试验材料  32-34
    3.1.1 拮抗细菌  32
    3.1.2 病原菌  32
    3.1.3 仪器和试剂  32-33
    3.1.4 培养基  33
    3.1.5 溶液配制  33-34
  3.2 试验方法  34-37
    3.2.1 菌种活化及保藏  34
    3.2.2 拮抗细菌发酵液的获得  34
    3.2.3 禾谷丝核菌菌碟的获得  34-35
    3.2.4 拮抗细菌发酵液对禾谷丝核菌抑菌能力测定  35
    3.2.5 发酵液对禾谷丝核菌结构的影响研究  35
    3.2.6 禾谷丝核菌细胞壁降解酶活性测定  35-37
  3.3 结果与分析  37-42
    3.3.1 拮抗细菌发酵液对禾谷丝核菌菌丝生长抑制作用  37-39
    3.3.2 发酵液对禾谷丝核菌结构的影响  39
    3.3.3 蛋白质和还原糖标准曲线  39-40
    3.3.4 拮抗细菌发酵液对禾谷丝核菌细胞壁降解酶活性的影响  40-42
  3.4 讨论  42-43
第四章拮抗细菌 RB5 发酵条件的响应面法优化  43-56
  4.1 试验材料  43
    4.1.1 拮抗菌株  43
    4.1.2 病原菌  43
    4.1.3 培养基  43
  4.2 试验方法  43-45
    4.2.1 菌种活化及保藏  43
    4.2.2 单因素优化  43-44
    4.2.3 PB 试验设计  44
    4.2.4 最陡爬坡实验  44-45
    4.2.5 响应面实验设计  45
  4.3 结果与分析  45-54
    4.3.1 C 源优化结果  45
    4.3.2 N 源优化结果  45-46
    4.3.4 发酵原料筛选结果  46
    4.3.5 PB 试验结果  46-48
    4.3.6 最陡爬坡实验结果与分析  48
    4.3.7 响应面优化实验结果与分析  48-54
    4.3.8 培养基最适组合  54
    4.3.9 模型的验证  54
  4.4 讨论  54-56
第五章生防菌株 RB5 活性物质初步研究  56-69
  5.1 试验材料  56-58
    5.1.1 供试菌株  56
    5.1.2 培养基  56-57
    5.1.3 缓冲液配置  57-58
  5.2 试验方法  58-63
    5.2.1 菌种活化及保藏  58
    5.2.2 发酵液样品的制备  58
    5.2.8 荧光色素的检验  58-59
    5.2.9 嗜铁素检测试验  59
    5.2.10 几种代谢产物的检测  59
    5.2.11 嗜铁素目的基因引物的设计  59
    5.2.12 拮抗物质的分子检测  59-60
    5.2.13 几丁质酶的提取与分离  60-63
    5.2.14 高效液相检测试验  63
  5.3 结果与分析  63-68
    5.3.1 荧光素检测实验结果  63-64
    5.3.2 嗜铁素验证结果  64
    5.3.3 嗜铁素目的基因  64
    5.3.4 分子检测代谢物质结果  64-65
    5.3.5 蛋白酶检测  65
    5.3.6 几丁质酶检测  65-66
    5.3.7 几丁质酶的提纯  66-67
    5.3.8 高效液相实验对比检测结果  67-68
  5.4 讨论  68-69
第六章发酵液的室内盆栽防效研究  69-72
  6.1 试验材料  69
    6.1.1 供试小麦  69
    6.1.2 病原菌  69
    6.1.3 发酵液  69
  6.2 试验方法  69-70
  6.3 结果与分析  70-71
    6.3.1 处理小麦的发病情况  70
    6.3.2 室内盆栽防效结果  70-71
  6.4 讨论  71-72
结论  72-73
参考文献  73-79
致谢  79-80
个人简历  80

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