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棉田重要土传病原菌分子检测技术

作　者: 姜腾飞
导　师: 简桂良
学　校: 中国农业科学院
专　业: 植物病理学
关键词: 棉花黄萎病棉花枯萎病棉花立枯病棉花红腐病 Nested PCR
分类号: S435.62
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

棉花历来是我国重要的农产品，据估计，在棉花不同生长过程中，从播种到收获可遭受40多种病害的威胁，其中包括多种土传病原菌的侵害。一些重要的土传病害往往能够引起棉花的苗病，而棉花苗病是危害棉花的主要病害，常造成棉田缺苗断垄，甚至成片死亡，严重影响着棉花的正常生长。通过对棉花苗期病害的调查发现，虽然，各个品种之间在抗病性上存在显著甚至是更显著的差异，但是即使在相对抗病的品种上，苗期病害的发病率依然很高。棉花成株期重要的土传病害棉花黄萎病和棉花枯萎病则危害更为严重，被称为棉花的癌症。因此,能够快速准确地检测这些土传病害病原菌，从而采取合适的防治措施，对保证棉花生产具有重要意义土壤是这些土传病原菌的主要存活场所，但是，土壤是微生物的大本营，分离培养十分困难。建立一套不需对病原物进行分离培养就能快速检测的方法，不仅对这些病害检测和诊断，对病原菌的检疫均有重要的意义，而且，对选育抗病棉花品种，以及品种的合理布局等都有着重要指导价值。本文对土壤、植株及种子的总DNA进行提取，用特异性引物，通过巢式PCR扩增建立起了一套棉花黄萎病菌、棉花枯萎病、棉花立枯病以及棉花红腐病的快速分子检测技术，可以对土壤、植株、种子内的上述病原菌进行快速检测，并具有高度的特异性和灵敏性。4种重要的土传病原菌巢氏PCR第一轮、第二轮引物分别为：棉花黄萎病落叶型特异性引物D1/D2和INTD2f/INTD2r；棉花黄萎病非落叶型特异性引物ND1/ND2和INTND2f/INTND2r；棉花红腐病特异性引物53-6F/53-6R和Fm3/Fm4；棉花枯萎病引物ITS1/ITS4和特异引物Fov1/Fov2；棉花立枯病引物ITS1/ITS4和特异性引物RsW1/RsW2。土壤检测表明，用Soil DNA Isolation ki（tMO BIO Laboratories,Inc生产）对带菌土壤总DNA进行提取，用上述引物可准确灵敏地检测出土壤中的上述4种病菌，对棉花黄萎病落叶型土壤检测下限为土壤中菌量密度为10²个孢子/克，对棉花黄萎病非落叶型土壤检测下限为土壤中菌量密度为10²个孢子/克，对棉花枯萎病土壤检测下限为土壤中菌量密度为10²个孢子/克，对棉花红腐病土壤检测下限为土壤中菌量密度为10²个孢子/克；棉花立枯病土壤检测下限为土壤中菌核密度为10^-5克菌核/克。用CTAB法对感染上述4种疾病棉花的总DNA进行提取，用特异引物进行巢式PCR扩增，不仅可以准确地鉴定发病植株内病原菌，同时还可准确检测显症前植株体内是否存在病原菌。通过对上述4种病害，发病前不同时期棉花根部进行检测表明，在棉花接种12到24小时后，便可以从根部检测到病原菌。对种子的检测表明，用CTAB法对可能感染这四种病害的种子总DNA进行提取后，通过对种子不同部位的检测发现，在种子的短绒和种壳中都可以检测到致病菌的存在，并可鉴定出其致病菌，但只有感染红腐病的种子，从胚中检测出致病菌的存在。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-14
第一章引言  14-21
  1.1 棉花病害  14-19
    1.1.1 棉田土传病害  14
    1.1.2 棉花黄萎病  14-16
    1.1.3 棉花枯萎病  16-17
    1.1.4 棉花立枯病  17-19
    1.1.5 棉花红腐病  19
  1.2 本研究目的意义、实验内容及技术路线  19-21
    1.2.1 研究的目的与意义  19-20
    1.2.2 本研究的实验内容  20
    1.2.3 技术路线  20-21
第二章不同棉花品种（系）对苗期根病抗性比较  21-26
  2.1 材料和方法  21
    2.1.1 棉花品种  21
    2.1.2 田间排列  21
    2.1.3 棉花苗期病害调查  21
    2.1.4 结果分析  21
  2.2 结果与分析  21-25
    2.2.1 棉苗红腐病  21-22
    2.2.2 棉苗炭疽病  22-24
    2.2.3 棉苗立枯病  24
    2.2.4 棉苗复合根病的比较  24-25
  2.3 结论与讨论  25-26
第三章棉田重要土传病原菌的分子检测  26-55
  3.1 材料与试剂  26-27
    3.1.1 供试材料  26
    3.1.2 供试菌系  26
    3.1.3 仪器设备  26
    3.1.4 生化试剂  26
    3.1.5 缓冲液及培养基  26-27
  3.2 试验方法  27-29
    3.2.1 棉苗的种植及接种  27-28
    3.2.2 DNA 的提取与方法  28-29
  3.3 棉花黄萎病的检测  29-31
    3.3.1 nested PCR 引物和条件  29-30
    3.3.2 引物特异性检测  30
    3.3.3 引物检测灵敏度测定  30
    3.3.4 种子不同部位棉花黄萎病菌的检测  30
    3.3.5 植株内黄萎病菌快速检测  30-31
    3.3.6 对棉田土壤的检测  31
  3.4 棉花枯萎病的检测  31-33
    3.4.1 扩增引物和条件  31
    3.4.2 引物特异性检测  31-32
    3.4.3 引物检测灵敏度测定  32
    3.4.4 种子不同部位棉花枯萎病菌的检测  32
    3.4.5 植株内枯萎病菌的快速检测  32
    3.4.6 对棉田土壤的检测  32-33
  3.5 棉花红腐病的检测  33-34
    3.5.1 扩增引物和条件  33
    3.5.2 引物特异性检测  33
    3.5.3 引物检测灵敏度测定  33-34
    3.5.4 种子不同部位棉花红腐病菌的检测  34
    3.5.5 植株内棉花红腐病菌的快速检测  34
    3.5.6 对棉田土壤的检测  34
  3.6 棉花立枯病的检测  34-36
    3.6.1 立枯丝核菌菌核浓度梯度的准备  34-35
    3.6.2 扩增引物和条件  35
    3.6.3 引物特异性检测  35
    3.6.4 引物检测灵敏度测定  35-36
    3.6.5 种子不同部位棉花立枯病菌的检测  36
    3.6.6 植株内棉花立枯病菌的快速检测  36
    3.6.7 对棉田土壤的检测  36
  3.7 结果与分析  36-54
    3.7.1 棉花黄萎病的检测  36-43
    3.7.2 棉花枯萎病的检测  43-47
    3.7.3 棉花红腐病的检测  47-50
    3.7.4 棉花立枯病的检测  50-54
  3.8 讨论  54-55
第四章全文结论  55-57
  4.1 苗期土传病害与抗性  55
  4.2 棉田重要土传病原菌快速分子检测技术  55-57
参考文献  57-61
致谢  61-62
作者简历  62

棉田重要土传病原菌分子检测技术

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