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荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens P-72-10菌株对烟草黑胫病的生防机理研究

作　者: 董国菊
导　师: 周常勇
学　校: 西南大学
专　业: 植物病理学
关键词: 烟草疫霉烟草黑胫病根际促生细菌荧光假单胞菌胞外代谢产物防病促生根部定殖
分类号: S435.72
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

烟草是一种重要的经济作物,由烟草疫霉Phytophthora nicotianae Breda de Haan引起的烟草黑胫病是烟草生产上的一种毁灭性真菌土传病害。该病原菌破坏性极强,烟株受害后易造成整株死亡,严重影响烟草生产。目前,生产上仍依赖于化学农药防治烟草黑胫病,但长期使用化学农药,容易诱发病原菌产生耐(抗)药性菌株,污染环境和破坏生态系统,同时烟草是叶用经济作物,农药残留会影响烟叶的品质。随着烟草及其制品向更加安全化方向发展的趋势,寻找一种安全、无毒、经济、有效和可持续发展的病害控制途径是当务之急。生物防治由于具有经济有效、且对环境安全友好的特点,被认为是一种最具潜力的、可替代化学农药的方法,现已成为植物病害防治研究的热点。鉴于此,本文以分离自连作烟田健康烟株根际土壤的5个细菌菌株为研究对象,从中筛选出对烟草疫霉具有高效拮抗作用的菌株；进一步围绕该高效菌株对病原菌的抑制机制、其在烟草幼苗根部的定殖规律以及对烟草生长的影响等方面展开系统深入的研究,初步探明该高效菌株的生防机理；在此基础上对该菌株进行鉴定并初步明确其最适的摇瓶培养条件。主要研究结果如下。高效拮抗烟草疫霉根际细菌菌株的筛选5个供试菌株中,除P-70-3菌株外,其余4个菌株对烟草疫霉均有很强的平板拮抗效果,且5个供试菌株的胞外代谢产物对病原菌也表现出不同程度的抑菌作用。其中,P-72-10菌株的拮抗效果和抑菌作用最强,平板对峙培养中抑菌带半径达13.0mm,相对抑制率为68.57%；其胞外代谢产物粗提液对病原菌的抑制作用随浓度的增加而增强,分别为24.92%(10-3)、27.18%(10-2)、39.84%(10-1)和46.03%(原液),且与对照相比差异显著(P<0.05)。P-72-10菌株对烟草黑胫病的温室控病效果该菌株的带菌培养液灌根处理烟草幼苗后,能减轻烟草植株的发病率和降低病情指数；其对抗病和感病品种的控病效果表现出一定的差别,相对防效分别为53.57%和66.37%,与对照处理相比均达到差异显著水平(P<0.05)。P-72-10菌株对烟草疫霉的抑制机制该菌株产生的挥发性代谢产物能抑制烟草疫霉菌丝的生长,相对抑制率达到32.94%。显微观察发现：对照菌丝形态饱满,细胞壁光滑,胞质均匀透明,分支正常；而平板对峙培养中受抑制菌落边缘的菌丝形态发生畸变,其菌丝不正常的分支增多,菌丝顶端细胞畸形生长,并在菌丝的顶端或中间均有泡囊形成；部分菌丝干瘪皱缩,原生质渗漏；还有部分菌丝出现扭曲集结的现象。该菌株的菌体悬浮液和无菌滤液均能诱发病原菌菌丝形态发生类似的畸变现象。该菌株能产生纤维素酶、蛋白酶和嗜铁素等抗菌物质。P-72-10菌株在烟草根部的定殖规律该菌株对抗生素利福平敏感,以利福平为标记抗生素,经不同浓度的利福平逐级选择压力诱导后,最终获得抗利福平(300μg/mL)的突变菌株P-72-10:Rifo该突变菌株的培养性状及对病原菌的拮抗能力与原始菌株无差异。通过种子细菌化,该突变菌株能成功地定殖于烟草幼苗的根部,其在根部的定殖动态呈现为先上升后下降的趋势；种子萌发出苗28天后,在烟草幼苗的根部仍能检测到P-72-10:Rif菌株,其定殖量维持在104cfu/g这一稳定的水平。扫描电镜定性观察发现P-72-10:Rif菌株在烟草幼苗根表不同部位的定殖分布呈现宏观不均匀性,根基部分布的菌体数量多于根中部,而根尖部分的细菌菌体数量最少。P-72-10菌株对烟草的促生效果及作用机制烟草种子经P-72-10菌株不同浓度的培养液浸种处理后,能促进幼根的伸长,其中,以10-1浓度促生效果最好,根长为0.53cm,而对照根长为0.47cm,与对照相比,增加了12.76%,且差异显著(P<0.05)；且种子的可溶性蛋白含量增加,总淀粉酶活性升高。培养液灌根处理烟草幼苗后,也能促进幼苗的生长及对N、P、K的吸收；增强光合效率、提高叶绿素含量；幼苗中丙二醛的积累量降低,与烟草植株抗性相关的防御酶(PPO、POD、PAL、几丁质酶和p-1,3-葡聚糖酶)活性升高,而各种防御酶活性的变化趋势不一致,其活性高峰出现时间与数量也有差异。P-72-10菌株的鉴定该菌株在King’s B培养基上菌落呈乳白色,且能产生水溶性的黄绿色荧光色素；为革兰氏阴性细菌,菌体杆状、大小(8.1-16.2)×(1.8-4.8)μm,单端生鞭毛,不形成芽孢。其最适生长温度为30℃；不耐盐；能利用柠檬酸盐和丙酸盐。接触酶反应阳性,氧化酶反应阳性,精氨酸双水解酶反应阳性,苯丙氨酸脱羧酶反应阴性,脂酶反应阴性,硝酸盐还原反应阴性；水解明胶和酪氨酸,但不水解淀粉；能发酵葡萄糖、木糖和甘露醇。该菌株基因组DNA的(G+C)mol%含量为60.72mol%,16SrDNA基因序列分析显示该菌株与假单胞菌属的荧光假单胞菌多个菌株的序列同源性达到99%,在GenBank上的登陆号为：HQ888871。因此,该菌株鉴定为荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens。P-72-10菌株摇瓶培养条件的优化摇瓶培养条件下,当pH为7.0、培养时间达52h、培养温度为25℃时,P-72-10菌株在标准发酵培养基中能获得最大量的抗菌物质,且其抑菌活性最高；该菌株的抗菌物质不能长时间地耐受高温处理。正交试验表明该菌株在摇瓶培养条件下获得抗菌物质的最佳发酵培养基组分配比为：葡萄糖23g,硫酸铵20g,硝酸钾5.5g,氯化钠0.5g,蒸馏水1000mL,pH为7.0。综上所述,在“根际细菌-植物-病原菌”这一微生态互作系统中,P-72-10菌株对烟草疫霉具有高效的拮抗作用,表现出良好的防病促生功效,且通过种子细菌化能成功地定殖于烟草根部,是一株具有应用潜力的生防荧光假单胞菌菌株。本研究也表明根际细菌在防治植物土传病害具有较强的应用优势和前景。

全文目录

摘要  10-12
ABSTRACT  12-15
第一部分文献综述  15-26
  第一章文献综述  16-24
    1 烟草黑胫病概述  16-19
      1.1 烟草黑胫病的发生与危害  16-17
      1.2 烟草黑胫病的防治现状  17-18
      1.3 烟草黑胫病的生物防治研究进展  18-19
    2 植物根际促生细菌的研究进展  19-21
      2.1 根际促生细菌的概念  19
      2.2 植物根际促生细菌的种类  19-20
      2.3 植物根际促生细菌的防病促生作用研究  20-21
    3 荧光假单胞菌的研究进展及生防应用  21-24
      3.1 拮抗作用  21-22
      3.2 营养与生态位点的竞争  22
      3.3 有效的根际定殖  22-23
      3.4 诱导植物系统抗病性  23-24
  第二章引言  24-26
第二部分高效拮抗菌株的筛选  26-36
  第三章高效拮抗烟草疫霉根际细菌菌株的筛选  28-36
    1 材料与方法  28-30
      1.1 试验材料  28-29
        1.1.1 供试培养基  28
        1.1.2 供试菌种  28
        1.1.3 供试烟草  28
        1.1.4 仪器设备  28-29
      1.2 试验方法  29-30
        1.2.1 5个菌株对烟草疫霉拮抗作用的测定  29
        1.2.2 菌株胞外代谢产物粗提液的制各  29
        1.2.3 5个菌株胞外代谢产物粗提液对病原菌的抑制作用  29
        1.2.4 烟草疫霉游动孢子悬浮液的制备  29
        1.2.5 高效拮抗菌株对烟草黑胫病的温室控病效果  29-30
      1.3 数据统计分析  30
    2 结果与分析  30-33
      2.1 5个菌株对烟草疫霉的平板拮抗效果  30-31
      2.2 5个菌株胞外代谢产物粗提液对病原菌的抑菌效果  31-33
      2.3 P-72-10菌株对烟草黑胫病的温室控病效果  33
    3 结论与讨论  33-36
第三部分高效括抗菌株的生防机理  36-66
  第四章 P-72-10菌株对烟草疫霉的抑菌机制  38-46
    1 材料与方法  38-40
      1.1 材料  38-39
        1.1.1 供试培养基  38
        1.1.2 供试菌种  38
        1.1.3 仪器设备  38-39
      1.2 试验方法  39-40
        1.2.1 P-72-10菌株胞外代谢产物粗提液的制备  39
        1.2.2 P-72-10菌株胞外代谢产物对病原菌菌丝生长量的影响  39
        1.2.3 P-72-10菌株挥发性代谢产物对病原菌的抑制作用  39
        1.2.4 P-72-10菌株对病原菌菌丝形态的影响  39
        1.2.5 P-72-10菌株拮抗代谢产物的初步分析  39-40
      1.3 数据统计分析  40
    2 结果与分析  40-43
      2.1 P-72-10菌株胞外代谢产物对病原菌菌丝生长量的抑制作用  40
      2.2 P-72-10菌株挥发性代谢产物对病原菌的抑制作用  40-41
      2.3 P-72-10菌株对病原菌菌丝形态的影响  41-42
      2.4 P-72-10菌株的拮抗代谢产物初步分析  42-43
    3 结论与讨论  43-46
  第五章 P-72-10菌株在烟草根部的定殖动态  46-56
    1 材料和方法  46-49
      1.1 材料  46-47
        1.1.1 供试菌种  46
        1.1.2 供试培养基  46
        1.1.3 供试烟草品种  46
        1.1.4 主要试剂  46
        1.1.5 仪器设备  46-47
      1.2 方法  47-49
        1.2.1 P-72-10菌株对抗生素的天然抗性测定  47
        1.2.2 抗生素标记菌株P-72-10的获得  47
        1.2.3 P-72-10：Rif标记菌株的遗传稳定性检测  47
        1.2.4 P-72-10原始菌株和标记菌株生长曲线的测定  47
        1.2.5 P-72-10：Rif标记菌株在烟草根部的定殖规律  47-49
    2 结果与分析  49-53
      2.1 P-72-10菌株对抗生素的天然抗性  49
      2.2 P-72-10菌株抗生素标记菌株的筛选及其稳定性  49-50
      2.3 P-72-10原始菌株和标记菌株的生长曲线  50-51
      2.4 P-72-10标记菌株在烟草幼苗根部的定殖动态  51-52
      2.5 P-72-10标记菌株在烟草幼苗根样不同部位的分布  52-53
    3 结论与讨论  53-56
  第六章 P-72-10菌株对烟草生长影响的初步研究  56-66
    1 材料与方法  56-59
      1.1 试验材料  56-57
        1.1.1 供试培养基  56
        1.1.2 供试菌种  56
        1.1.3 烟草品种  56
        1.1.4 主要试剂  56
        1.1.5 仪器设备  56-57
      1.2 试验方法  57-59
        1.2.1 P-72-10菌株带菌培养液的制备  57
        1.2.2 P-72-10菌株对烟草种子萌发后幼根伸长的影响  57
        1.2.3 P-72-10菌株对种子萌发时可溶性蛋白含量和总淀粉酶活性的影响  57
        1.2.4 P-72-10菌株对烟草幼苗生长的影响  57-58
        1.2.5 P-72-10菌株对烟草幼苗生理生化的影响  58
        1.2.6 P-72-10菌株对烟草植株防御酶活性的影响  58-59
      1.3 数据统计分析  59
    2 结果与分析  59-63
      2.1 P-72-10菌株对烟草种子萌发的影响  59
      2.2 P-72-10菌株对种子可溶性蛋白含量和总淀粉酶活性的影响  59-60
      2.3 P-72-10菌株对烟草幼苗生长的影响  60-61
      2.4 P-72-10菌株对烟草吸收氮磷钾的影响  61
      2.5 P-72-10菌株对烟草幼苗净光合速率和叶绿素含量的影响  61
      2.6 P-72-10菌株对烟草丙二醛含量的影响  61-62
      2.7 P-72-10菌株对烟草幼苗防御酶活性的影响  62-63
    3 结论与讨论  63-66
第四部分 P-72-10菌株的鉴定  66-84
  第七章 P-72-10菌株的鉴定  68-84
    1 材料和方法  68-77
      1.1 材料  68-70
        1.1.1 供试菌种  68
        1.1.2 供试培养基  68-69
        1.1.3 主要试剂  69-70
        1.1.4 仪器设备  70
      1.2 方法  70-77
        1.2.1 P-72-10菌株的培养性状  70-71
        1.2.2 P-72-10菌株菌体的形态特征  71-72
        1.2.3 P-72-10菌株的生理特性测定  72
        1.2.4 P-72-10菌株的生化特性测定  72-75
        1.2.5 BIOLOG细菌自动鉴定系统  75
        1.2.6 P-72-10菌株的分子鉴定  75-77
    2 结果与分析  77-82
      2.1 P-72-10菌株的培养性状  77
      2.2 P-72-10菌株的形态特征  77-78
      2.3 P-72-10菌株的生理生化特性  78-80
      2.4 P-72-10菌株基因组DNA的(G+C)mol%含量  80
      2.5 P-72-10菌株的16S rDNA-PCR产物的序列分析  80-82
    3 结论与讨论  82-84
第五部分 P-72-10菌株摇瓶培养条件的优化  84-97
  第八章 P-72-10菌株摇瓶培养条件的优化  85-93
    1 材料与方法  85-87
      1.1 材料  85-86
        1.1.1 供试菌种  85
        1.1.2 供试培养基  85
        1.1.3 仪器设备  85-86
      1.2 方法  86-87
        1.2.1 P-72-10菌株胞外代谢产物粗体液的制备  86
        1.2.2 初始pH对P-72-10菌株抗菌物质产生和积累的影响  86
        1.2.3 培养时间对P-72-10菌株抗菌物质产生和积累的影响  86
        1.2.4 培养温度对P-72-10菌株抗菌物质产生和积累的影响  86
        1.2.5 培养基组分对P-72-10菌株抗菌物质产生和积累的影响  86
        1.2.6 P-72-10菌株抗菌物质对温度的稳定性测定  86
        1.2.7 P-72-10菌株对碳/氮源的利用及最佳培养基因子配比的优化  86-87
    2 结果与分析  87-91
      2.1 初始pH对P-72-10菌株抗菌物质产生与积累的影响  87
      2.2 培养时间对P-72-10菌株抗菌物质产生与积累的影响  87-88
      2.3 培养温度对P-72-10菌株抗菌物质产生与积累的影响  88
      2.4 培养基组分对P-72-10菌株抗菌物质产生与积累的影响  88
      2.5 P-72-10菌株抗菌物质对温度的敏感性  88-89
      2.6 P-72-10菌株对碳/氮源的利用及最佳培养基因子配比的优化  89-91
        2.6.1 P-72-10菌株对不同碳源的利用  89
        2.6.2 P-72-10菌株对不同氮源的利用  89-90
        2.6.3 正交试验及最佳培养基因子配比的优化  90-91
    3 结论与讨论  91-93
  第九章总结  93-97
    1 主要研究结论  93-94
    2 主要研究特色  94
    3 有待进一步研究的问题及研究方向  94-97
      3.1 P-72-10菌株诱发病原菌的畸变机理  94
      3.2 P-72-10菌株的定殖规律与防病促生功效之间的相关性  94
      3.3 P-72-10菌株诱导抗性表达的时空效应  94-95
      3.4 P-72-10菌株的菌剂研发  95-97
参考文献  97-109
致谢  109-111
攻读博士期间发表论文目录  111-112
攻读博士期间参加的科研项目  112

荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens P-72-10菌株对烟草黑胫病的生防机理研究

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