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红色糖多孢菌基因组、转录组和GlnR功能研究

作　者: 李豪
导　师: 叶邦策
学　校: 华东理工大学
专　业: 食品科学
关键词: 红色糖多孢菌 功能基因组学 调控机制 G1nR
分类号: Q93
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


红色糖多孢菌是一种工业上规模化生产红霉素的放线菌。由于红霉素及其衍生物的广泛应用,对红色糖多孢菌的改造以提高红霉素产量的研究非常多。本研究中的红色糖多孢菌HL3168 E3(以下简称E3)即为工业上通过菌种筛选得到的红霉素高产菌。本课题首先从基因组测序和转录组两个方面对红霉糖多孢菌工业生产菌E3和模式菌NRRL23338进行比较研究,发掘红霉素合成调控机制。通过对E3基因组测序发现,与NRRL23338基因组相比,共有60个插入突变,46个缺失突变和584个单碱基突变。通过转录组分析发现E3菌中红霉素合成及其供给途径中的基因发生了显著的表达上调,而氮代谢中的基因明显被抑制。另外,我们综合分析基因组和转录组数据,得到几个可能对E3菌红霉素高产起到关键作用的调控因子。这些发现有助于揭示红色糖多孢菌红霉素合成的调控机制,为基因工程和代谢工程提高红霉素产量提供了理论基础。在此基础上针对氮代谢中的重要转录调控因子GlnR展开相关功能研究,了解其作用机制。通过大肠杆菌克隆表达系统体外表达得到了GlnR蛋白,并用ESMA实验分析验证在氮代谢中有12个操纵子上游调控序列存在GlnR结合位点。基于上述实验结果,利用N4EME在线分析软件预测了可能的GlnR结合保守序列。这为探索红霉素合成调控机制提供了一个新的突破点。

全文目录


摘要  5-6
Abstract  6-11
第1章 绪论  11-23
  1.1 红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)简介  11-15
    1.1.1 红霉素(erythromycin,Er)简介  11-12
    1.1.2 红霉素的生物合成  12-14
      1.1.2.1 与红霉素合成相关的基因  12-13
      1.1.2.2 红霉素合成的生化途径  13-14
    1.1.3 红霉素的基因工程研究进展  14-15
  1.2 功能基因组学  15-17
    1.2.1 DNA水平上的功能基因组学  15-16
    1.2.2 RNA水平上的功能基因组学  16-17
    1.2.3 其他层面的功能基因组学研究  17
  1.3 基因表达调控研究方法  17-21
    1.3.1 凝胶迁移率电泳  17-18
    1.3.2 染色质免疫共沉淀技术  18-19
    1.3.3 基因组SELEX技术  19-20
    1.3.4 DNA亲和捕获分析  20-21
  1.4 转录调控因子GlnR  21-22
  1.5 研究目的和意义  22-23
第2章 红色糖多孢菌基因组测序和转录组研究  23-44
  2.1 引言  23
  2.2 实验材料  23-25
    2.2.1 菌种  23
    2.2.2 实验试剂  23-24
    2.2.3 实验仪器  24
    2.2.4 培养基和溶液  24-25
      2.2.4.1 培养基的配制  24-25
  2.3 实验方法  25-28
    2.3.1 生产菌E3基因组测序  25-26
      2.3.1.1 菌种培养  25
      2.3.1.2 E3菌株基因组DNA提取  25-26
      2.3.1.3 生产菌E3基因组测序  26
      2.3.1.4 基因组功能注释和分析  26
    2.3.2 生产菌E3和野生菌NRRL23338表达谱芯片制备  26-28
      2.3.2.1 菌种发酵培养  26
      2.3.2.2 发酵过程中样品效价的测定  26-27
      2.3.2.3 RNA抽提  27-28
      2.3.2.4 总RNA纯度和浓度检测  28
      2.3.2.5 总RNA的OD_(260)/OD_(280)检测  28
      2.3.2.6 RNA电泳  28
      2.3.2.7 表达谱芯片杂交  28
      2.3.2.8 表达谱芯片数据分析  28
  2.4 实验结果与分析  28-32
    2.4.1 基因组DNA提取  28-29
    2.4.2 发酵过程中样品红霉素效价测定  29-30
    2.4.3 RNA电泳  30-31
    2.4.4 表达谱芯片扫描和数据处理  31-32
  2.5 数据分析与结论  32-42
    2.5.1 S.erythraea E3菌基因组特点及其与NRRL23338比较  32-35
    2.5.2 E3菌和NRRL23338菌转录组分析  35-39
      2.5.2.1 红霉素生物合成途径及其供给途径  36-37
      2.5.2.2 转运蛋白  37-38
      2.5.2.3 能量代谢  38
      2.5.2.4 次级代谢产物合成  38-39
    2.5.3 功能基因组分析  39-42
  2.6 讨论  42-44
第3章 红色糖多孢菌中GlnR转录调控因子功能研究  44-74
  3.1 引言  44
  3.2 实验材料  44-49
    3.2.1 菌种与质粒  44
    3.2.2 药品与试剂  44-45
    3.2.3 实验仪器  45-46
    3.2.4 常用溶液存储液的配制  46-49
      3.2.4.1 常用缓冲液  46
      3.2.4.2 抗生素和IPTG存储液  46
      3.2.4.3 培养基  46-47
      3.2.4.4 SDS-PAGE电泳相关溶液  47-48
      3.2.4.5 重组蛋白纯化相关溶液的配制  48-49
  3.3 实验方法  49-63
    3.3.1 glnR基因的获取  49-51
      3.3.1.1 红色糖多孢菌的培养  49
      3.3.1.2 红色糖多孢菌基因组的抽提  49
      3.3.1.3 PCR特异扩增目的基因片段  49-51
        3.3.1.3.1 引物设计  50
        3.3.1.3.2 PCR扩增获得glnR基因  50
        3.3.1.3.3 glnR基因片段的纯化回收  50-51
    3.3.2 pET-28a(+)质粒的抽提  51-52
    3.3.3 glnR基因和pET-28a(+)质粒的酶切、连接  52-53
      3.3.3.1 glnR基因和pET-28a(+)质粒的定量  52
      3.3.3.2 glnR基因和pET-28a(+)质粒的酶切  52-53
      3.3.3.3 glnR基因和pET-28a(+)质粒的连接  53
    3.3.4 连接产物转化大肠杆菌DH5α  53-55
      3.3.4.1 大肠杆菌DH5α感受态的制备  53-54
      3.3.4.2 连接产物glnR/pET-28a(+)转化DH5α感受态细胞  54
      3.3.4.3 glnR/pET-28a(+)/DH5α的筛选  54-55
    3.3.5 glnR/pET-28a(+)转化表达菌BL21(DE3)  55
      3.3.5.1 提取glnR/pET-28a(+)质粒  55
      3.3.5.2 制备大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞  55
      3.3.5.3 重组质粒glnR/pET-28a(+)转化BL21(DE3)感受态细胞  55
      3.3.5.4 筛选glnR/pET-28a(+)/BL21(DE3)阳性克隆  55
    3.3.6 GlnR蛋白的诱导表达  55-57
      3.3.6.1 IPTG诱导表达GlnR蛋白  56
      3.3.6.2 SDS-PAGE电泳检验GlnR蛋白诱导表达情况  56-57
    3.3.7 GlnR蛋白的制备  57-58
      3.3.7.1 纯化目的蛋白His-GlnR  57-58
      3.3.7.2 重组蛋白His-GlnR定量  58
    3.3.8 PCR扩增可能的目的结合序列  58-62
    3.3.9 凝胶阻滞分析GlnR调控靶基因  62-63
      3.3.9.1 非变性聚丙烯酰胺凝胶配制  62-63
      3.3.9.2 EMSA反应体系的建立  63
      3.3.9.3 PAGE凝胶染色  63
    3.3.10 MEME在线分析GlnR的靶序列  63
    3.3.11 验证GlnR结合位点  63
  3.4 结果与分析  63-70
    3.4.1 glnR基因的获取  63-64
      3.4.1.1 红色糖多孢菌基因组的抽提  63-64
      3.4.1.2 glnR基因的PCR扩增  64
    3.4.2 glnR/pET-28a(+)/BL21(DE3)的构建  64-65
      3.4.2.1 pET-28a(+)质粒的抽提  64-65
      3.4.2.2 glnR基因和pET-28a(+)质粒的酶切、连接  65
      3.4.2.3 glnR/pET-28a(+)的转化DH5α的验证  65
    3.4.3 GlnR蛋白诱导表达  65-66
    3.4.4 GlnR蛋白的纯化  66-67
    3.4.5 GlnR蛋白定量  67
    3.4.6 PCR扩增DNA探针  67-68
    3.4.7 EMSA分析GlnR的靶标基因  68-69
    3.4.8 MEME在线分析GlnR的靶序列  69
    3.4.9 验证GlnR结合位点  69-70
  3.5 结论及讨论  70-74
    3.5.1 结论  70
    3.5.2 讨论  70-74
第4章 总结  74-75
参考文献  75-80
致谢  80

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中图分类: > 生物科学 > 微生物学
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