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青霉Penicillium sp.B01产菊粉酶稳定化研究

作　者: 辛本荣
导　师: 刘兆普
学　校: 南京农业大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 青霉菊粉酶酶保护剂固定化
分类号: TQ925
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

菊粉是由D-呋喃果糖以p-2-1-糖苷键连接的多聚果糖,其还原端接一个葡萄糖基,富含于菊科植物中尤其是菊芋中,其干重菊粉含量能达到70%-80%。菊芋适应性强,耐贫瘠,种植简易,产量高,是制备果糖或高果糖浆、菊粉寡糖和燃料酒精的极好原料。菊粉酶是水解菊粉的高效专一作用剂,主要来源于微生物,如酵母,青霉,黑曲霉等。酶解产物为低聚果糖,低聚果糖是功能性食品添加剂,既能作为肠道有益菌群的双歧因子,又能降低胆固醇,改善脂质代谢,其多种保健功能使得低聚果糖受到生产者和消费者的青睐。本研究以从山东莱州国家863中试基地筛选出的高产菊粉酶菌株Penicillium sp.B01为研究材料,以提高其产酶的稳定性为目的,研究了添加菊粉酶保护剂,固定化菊粉酶和固定化青霉细胞对其产酶活性的影响。得到结果如下：1通过单因子实验得出聚乙二醇、甘油、山梨醇和CaCl2对菊粉酶的稳定性有较好的保持作用,乙醇和山梨酸钾则使酶的活性丧失。通过正交实验筛选出最佳酶保护剂配方,为聚乙二醇2%,甘油5%,山梨醇1g.L-1,CaCl24%2采用海藻酸钠包埋法制备固定化青霉产菊粉酶。结果表明固定化最佳比例为海藻酸钠浓度为4%,CaCl2浓度为1%。固定化菊粉酶最佳反应条件为pH4.5,温度55℃,与游离酶相比,固定化酶在pH和温度适应性方面均有所提高。在固定化酶重复利用性方面,制成的固定化酶在和游离酶同样反应条件下反应7次,酶活仍达到原酶活的50.6%。海藻酸钠包埋法制定的固定化菊粉酶在各个指标上均优于游离酶,有潜在的工业应用价值。3通过四种固定化细胞方法的比较,得出海藻酸钠-CaCl2包埋法是相对较好的方法。海藻酸钠浓度为2%,菌体量为10g/100mL时,酶活回收率可达到47.22%。考察用海藻酸钠固定化法的pH,温度与游离细胞相比的稳定性,发现最适pH酸移,为4.0。在温度适应最适底物浓度为4%。研究海藻酸钠包埋法固定青霉的储存稳定性。发现经过固定的青霉在48h后仍具有活力。青霉Penicillium sp.B01发酵时间短,容易培养,是研究细胞固定化的好材料。

全文目录

项目来源  4-5
目录  5-8
摘要  8-10
ABSTRACT  10-12
缩略词  12-13
第一章文献综述  13-27
  1.1 菊芋  13
  1.2 菊粉  13-14
  1.3 菊粉酶  14-18
    1.3.1 菊粉酶的研究历史  14-15
    1.3.2 菊粉酶的微生物来源  15-16
    1.3.3 菊粉酶的分类  16-17
    1.3.4 菊粉酶的应用  17-18
  1.4 菊粉酶稳定化研究  18-25
    1.4.1 固定化酶  18-23
      1.4.1.1 固定化酶技术研究进展  18-20
      1.4.1.2 酶的固定化方法  20-23
    1.4.2 细胞固定化研究  23-24
    1.4.3 酶保护剂研究  24
    1.4.4 酶的非共价修饰  24-25
    1.4.5 蛋白质工程在酶工程中的应用  25
  1.5 本课题立题意义及研究主要内容  25-27
第二章各种酶保护剂对菊粉酶活性的影响  27-35
  2.1 材料与方法  27-30
    2.1.1 实验材料  27
    2.1.2 仪器与设备  27
    2.1.3 试剂  27-28
    2.1.4 主要培养基配方  28
    2.1.5 实验方法  28-30
      2.1.5.1 DNS试剂的配置  28
      2.1.5.2 果糖标准曲线的制备  28-29
      2.1.5.3 孢子悬液的制备  29
      2.1.5.4 菊粉酶粗酶液的制备  29
      2.1.5.5 菊芋提取液的制备  29
      2.1.5.6 酶活测定方法  29
      2.1.5.7 还原糖含量的测定  29
      2.1.5.8 菊粉酶稳定剂储液的配制  29-30
      2.1.5.9 加酶保护剂后酶热稳定性的测定  30
      2.1.5.10 正交实验筛选最佳酶保护剂配方  30
  2.2 结果与分析  30-32
    2.2.1 单一保护剂对酶活性的影响  30-31
    2.2.2 正交实验筛选最佳酶保护剂配方  31-32
  2.3 讨论  32-34
  2.4 本章小结  34-35
第三章海藻酸钠包埋法固定菊粉酶研究  35-43
  3.1 材料与方法  35-37
    3.1.1 材料  35
    3.1.2 试剂与仪器  35
    3.1.3 培养基  35-36
    3.1.4 实验方法  36-37
      3.1.4.1 菊粉酶粗酶液的制备  36
      3.1.4.2 酶活测定方法及酶活回收率的计算  36
      3.1.4.3 海藻酸钠浓度对固定化酶活力的影响  36
      3.1.4.4 CaCl_2浓度对固定化酶活力的影响  36
      3.1.4.5 浓度为4%海藻酸钠在不同加酶量中的固定化效率  36
      3.1.4.6 pH稳定性与温度稳定性实验  36-37
  3.3 结果与分析  37-41
    3.3.1 海藻酸钠浓度对固定化酶活力的影响  37
    3.3.2 CaCl_2浓度对固定化酶活力的影响  37-38
    3.3.3 浓度为4%的海藻酸钠在不同加酶量中的固定化效率  38-39
    3.3.4 固定化酶与游离酶在不同pH值下的稳定性  39-40
    3.3.5 固定化酶与游离酶在不同温度下的稳定性  40-41
    3.3.6 固定化酶的重复利用性  41
  3.4 讨论  41-42
  3.5 本章小结  42-43
第四章青霉细胞固定化方法研究  43-51
  4.1 材料与方法  43-45
    4.1.1 供试菌株  43
    4.1.2 试剂  43
    4.1.3 仪器设备  43
    4.1.4 青霉培养条件  43-44
    4.1.5 细胞固定化方法  44
      4.1.5.1 海藻酸钠-戊二醛包埋法  44
      4.1.5.2 海藻酸钠包埋法  44
      4.1.5.3 PVA-H_3BO_3包埋法  44
      4.1.5.4 戊二醛交联法  44
    4.1.6 游离细胞酶活力计算  44
    4.1.7 固定化细胞酶活的测定  44-45
    4.1.8 海藻酸钠浓度对固定化细胞活性的影响  45
    4.1.9 固定化细胞的pH稳定性  45
    4.1.10 固定化细胞的温度稳定性  45
    4.1.11 底物浓度对固定化细胞转化率的影响  45
  4.2 结果与讨论  45-49
    4.2.1 细胞生长及产酶曲线  46
    4.2.2 四种固定化青霉方法的比较  46-47
    4.2.3 不同浓度海藻酸钠对固定化细胞产酶活力的影响  47
    4.2.4 固定化细胞在不同pH下的稳定性  47-48
    4.2.5 固定化细胞在不同温度下的稳定性  48
    4.2.6 底物浓度对固定化细胞转化率的影响  48-49
  4.3 讨论  49
  4.4 结论  49-51
全文总结  51-53
全文创新点  53-55
存在问题与展望  55-57
参考文献  57-65
在读硕士期间(2007-2009)已发表或待发表的论文  65-67
致谢  67

青霉Penicillium sp.B01产菊粉酶稳定化研究

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