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五味子多糖的分离、结构鉴定及免疫活性研究

作　者: 汪艳群
导　师: 孟宪军
学　校: 沈阳农业大学
专　业: 食品科学
关键词: 五味子多糖提取纯化结构抗氧化免疫
分类号: TQ914
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

五味子（Schisandra chinensis (Turcz.) Baill），木兰科五味子属植物，主要分布于辽宁、吉林、黑龙江等地，是一种药食两用的资源。早期国内外对五味子研究多集中在木脂素、三萜、挥发油等脂溶性成分上，生产中提取过脂溶性成分的五味子常作为残渣被废弃，而近年来发现五味子水溶性成分中含有大量多糖，引起研究者的关注。本文以提取过脂溶性成分的五味子残渣为原料，研究五味子多糖的提取工艺、分离纯化技术，并对得到的五味子多糖进行了理化性质、结构、抗氧化作用及免疫调节活性研究，以期为五味子的产业化开发奠定基础。主要结论如下：1、利用Design Expert7.0和Minitab15两款专业软件通过响应面法（RSM）优化传统热水浸提、超声波辅助提取及酶解辅助提取五味子多糖的工艺。（1）热水浸提法的最佳工艺条件为：料液比1:40，提取温度90.3℃，提取时间5h，五味子粗多糖的提取率为（10.99±0.22）%；（2）超声波辅助提取法的最佳预处理条件为：料液比1:40，超声波功率为300W，处理时间为1h，处理温度为30℃，预处理后进行热水浸提，五味子粗多糖的提取率为（16.73±0.25）%；（3）酶解辅助提取法的最佳预处理条件为：料液比1:40，果胶酶用量为1.19%，酶解时间为4h，温度为30℃，酶解pH值为4.21，酶解后迅速升温至100℃，15min灭酶，调整pH为中性，然后进行热水浸提，五味子粗多糖的提取率为（20.82±0.25）%。2、利用溶剂法、酶法、柱层析法对五味子粗多糖进行纯化，结果表明：最佳脱蛋白方法为酶法与三氯乙酸-正丁醇法结合，酶解条件为：蛋白酶用量为1%、酶解温度为50℃、酶解时间为140min、pH值为5，酶解之后再用三氯乙酸-正丁醇法处理4次，可除去蛋白质，多糖保留率为68.3%。脱蛋白后用聚酰胺柱层析进行脱色和分离，得到三个组分SCP-A、SCP-B和SCP-C，分别占多糖总量的67.3%、2.42%、1.35%；将SCP-A经Sephacryl S-300HR凝胶柱层析后分离得到一个组分SCP-0，将SCP-0经紫外光谱、Sephacryl S-300HR凝胶柱层析法、醋酸纤维薄膜电泳法及凝胶色谱法进行纯度鉴定，表明其为均一度较高的多糖，纯度达94.6%。将SCP-0经HPLC进一步纯化，得到SCP-01，经高效液相凝胶色谱法鉴定为单一尖锐对称峰形，其分子量分布宽度Mw/Mn为1.22，表明其为高纯度均一多糖。3、五味子多糖的理化性质研究表明：（1）五味子多糖溶解性受温度影响较大，低温下不易于溶解，60℃为其适宜溶解温度；在食品加工中常见的盐浓度和酸碱度下都有较好溶解性，受盐浓度和pH值的影响较小，碱性条件下溶解更快。（2）五味子多糖溶液的粘度受浓度和温度影响较大，随着浓度增大，粘度显著提高；随着温度升高，粘度下降。五味子多糖溶液的粘度受NaCl溶液浓度、pH值和热处理的影响较小，具有较好的加工稳定性。（3）五味子多糖SCP-0总糖含量为88.7%，糖醛酸含量为12.7%，重均分子量为394kDa。（4）超声波处理会使五味子多糖降解，平均分子量下降。4、利用高效液相色谱、气相色谱、红外光谱、原子力显微镜等结合多糖的经典化学分析方法，对五味子多糖SCP-01的化学组成及结构进行了初步研究，结果表明：（1）五味子多糖含有Man、Rha、Glc、Ara；各单糖摩尔比为Man：Rha：Glc：Ara=3.6：2.25：9.08：1。（2）含有α-D-吡喃糖苷及α-D-Man，无β构型或含量很低。（3）分子中1→、1→6键型的糖残基约占31.68%；1→2、1→2，6、1→4、1→4，6键型的糖残基约占28.64%；1→3、1→2，3、1→2，4、1→3，4、1→3，6、1→2，3，4的糖残基约占39.68%；每3.2个糖残基有一个非还原末端1→或1→6糖苷键。（4）分子主链由Glc、Man、Rha和Ara以1→、1→6和1→4、1→4，6键构成，并有少量Man和部分Glc以1→3、1→2，3、1→2，4、1→3，4、1→3，6、1→2，3，4键型间隔存在其中；支链由Glc、Man和少量GlcA以1→3、1→2，3、1→2，4、1→3，4、1→3，6、1→2，3，4键构成。（5）五味子多糖分子为带支链的多分枝结构，分子链高度为0.35~0.7nm；分子间存在螺旋(有序)和线圈(无序)结构，在水溶液中，依聚集程度不同，聚集体的形态可为多分枝团簇状、螺旋状、凝胶网络状、颗粒状等。5、体外抗氧化试验表明：传统浸提和超声波辅助提取的五味子多糖对羟自由基（·OH）和DPPH自由基（DPPH·）有较强的清除作用，对DPPH·的清除能力要强于对·OH的清除能力；且清除作用随多糖浓度增加而提高；但对清除超氧阴离子自由基（·O2-）几乎没有作用。超声波辅助提取的五味子多糖其清除自由基能力强于传统浸提的五味子多糖。6、体外细胞试验表明：（1）传统浸提和超声波辅助提取的五味子多糖都具有不同程度的促进小鼠脾淋巴细胞体外增殖的作用，其中以传统浸提的SCP-0的作用最强，其次为超声波辅助提取的SCP-3。（2）SCP-0、SCP-3对人PBMC的体外增殖具有较好刺激作用：在一定浓度范围内，单独作用即可刺激PBMC极显著地增殖；对PHA和LPS诱导的增殖作用也有极显著的促进作用；其余各样品，对人PBMC的体外增殖无明显作用。（3）SCP-0具有刺激细胞因子分泌的作用。在一定浓度范围内，单独作用于PBMC时，可显著刺激细胞因子IFN-γ、IL-4和TNF-α的分泌；并可以显著促进PHA刺激细胞因子IFN-γ、IL-4和TNF-α的分泌；但对LPS刺激PBMC分泌细胞因子IFN-γ、IL-4和TNF-α的作用无显著性影响。（4）在一定浓度范围内，SCP-0单独使用或与LPS联合使用，均可极显著地刺激PBMC产生抗体IgM和IgG；与LPS联合使用，该刺激作用更显著。7、动物试验表明，五味子多糖SCP-0可逆转环磷酰胺对小鼠非特异性和特异性免疫功能的抑制作用，对免疫低下动物模型的免疫功能有良好的调节作用：（1）可显著增强免疫抑制小鼠的碳廓清能力、血清溶血素水平、抗体形成细胞水平，促进ConA和LPS诱导的脾淋巴细胞增殖、提高脾脏NK细胞的杀伤活性；（2）可显著提高免疫抑制小鼠血清INF-γ、TNF-α和IL-4水平；（3）可显著提高免疫抑制小鼠肝组织中SOD、CAT和GSH-PX活性，降低肝组织中MDA水平。

全文目录

摘要  12-15
Abstract  15-18
第一章前言  18-43
  1.1 引言  18-19
  1.2 植物活性多糖的研究概况  19-36
    1.2.1 植物活性多糖的提取技术  19-21
    1.2.2 植物活性多糖的分离纯化  21-23
    1.2.3 植物活性多糖的分析鉴定  23-24
    1.2.4 多糖的结构测定和分析方法  24-29
    1.2.5 多糖的免疫调节活性研究  29-36
  1.3 五味子及五味子多糖研究概况  36-40
    1.3.1 五味子的种类  36
    1.3.2 五味子的化学成分  36
    1.3.3 五味子的保健功能  36
    1.3.4 五味子多糖研究进展  36-40
  1.4 本课题研究的目的、意义及主要研究内容  40-43
    1.4.1 目的及意义  40-41
    1.4.2 研究内容  41-43
第二章五味子多糖提取工艺研究  43-69
  2.1 材料与方法  43-47
    2.1.1 材料与试剂  43-44
    2.1.2 主要仪器  44
    2.1.3 试验方法  44-47
  2.2 结果与分析  47-66
    2.2.1 葡萄糖标准曲线与多糖换算系数  47-48
    2.2.2 热水浸提工艺的优化  48-54
    2.2.3 超声波预处理条件的优化  54-59
    2.2.4 果胶酶预处理条件的优化  59-65
    2.2.5 醇沉条件的确定  65-66
  2.3 讨论  66-67
  2.4 结论  67-69
第三章五味子多糖的分离纯化技术研究  69-88
  3.1 材料与方法  69-73
    3.1.1 主要材料与试剂  69-70
    3.1.2 主要仪器与设备  70
    3.1.3 试验方法  70-73
  3.2 结果与分析  73-85
    3.2.1 五味子多糖脱蛋白方法研究  73-80
    3.2.2 五味子多糖的柱层析  80-82
    3.2.3 五味子多糖的纯度鉴定  82-85
  3.3 讨论  85-87
  3.4 结论  87-88
第四章五味子多糖的理化性质研究  88-102
  4.1 材料与方法  88-91
    4.1.1 主要试剂及材料  88
    4.1.2 主要仪器与设备  88-89
    4.1.3 试验方法  89-91
  4.2 结果与分析  91-100
    4.2.1 五味子多糖的溶解性  91-93
    4.2.2 五味子多糖的粘度特性  93-96
    4.2.3 五味子多糖的相对分子量及分布  96-100
    4.2.4 五味子多糖的糖醛酸含量测定  100
  4.3 讨论  100-101
  4.4 结论  101-102
第五章五味子多糖结构的初步分析  102-119
  5.1 材料与方法  102-105
    5.1.1 主要材料及试剂  102
    5.1.2 主要仪器与设备  102-103
    5.1.3 试验方法  103-105
  5.2 结果与分析  105-116
    5.2.1 五味子多糖 SCP-01 的单糖组成  105-106
    5.2.2 五味子多糖 SCP-01 的红外光谱  106-108
    5.2.3 五味子多糖 SCP-01 的高碘酸氧化和 Smith 降解  108-113
    5.2.4 五味子多糖 SCP-01 的原子力显微镜（AFM）观察  113-116
  5.3 讨论  116-117
  5.4 结论  117-119
第六章五味子多糖的体外抗氧化活性研究  119-130
  6.1 材料与方法  119-123
    6.1.1 主要材料与试剂  119-120
    6.1.2 主要仪器设备  120
    6.1.3 试验方法  120-123
  6.2 结果与分析  123-127
    6.2.1 五味子多糖对羟基自由基（·OH）清除能力的测定  123-124
    6.2.2 五味子多糖对超氧阴离子自由基（·O~(2-)）清除能力的测定  124
    6.2.3 五味子多糖对 DPPH 自由基（DPPH·）清除能力的测定  124-125
    6.2.4 五味子多糖抗猪油氧化能力的测定  125-127
  6.3 讨论  127-129
  6.4 结论  129-130
第七章五味子多糖体外免疫活性研究  130-147
  7.1 材料与方法  130-135
    7.1.1 材料  130
    7.1.2 主要试剂  130-131
    7.1.3 主要仪器与设备  131
    7.1.4 试验动物  131
    7.1.5 试验方法  131-135
    7.1.6 数据处理及统计  135
  7.2 结果与分析  135-144
    7.2.1 五味子多糖对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响  135-138
    7.2.2 五味子多糖对人外周血单个核细胞免疫功能的影响  138-144
  7.3 讨论  144-145
  7.4 结论  145-147
第八章五味子多糖对免疫抑制小鼠免疫功能的影响  147-167
  8.1 材料与方法  147-154
    8.1.1 材料  147
    8.1.2 主要试剂  147-148
    8.1.3 主要仪器与设备  148
    8.1.4 试验动物  148
    8.1.5 试验方法  148-153
    8.1.6 数据处理及统计  153-154
  8.2 结果与分析  154-162
    8.2.1 五味子多糖对免疫抑制小鼠免疫器官的影响  154-155
    8.2.2 五味子多糖对免疫抑制小鼠单核/巨噬细胞功能的影响  155-156
    8.2.3 五味子多糖对免疫抑制小鼠体液免疫功能的影响  156-157
    8.2.4 五味子多糖对免疫抑制小鼠细胞免疫功能的影响  157-159
    8.2.5 五味子多糖对免疫抑制小鼠 NK 细胞活性的影响  159
    8.2.6 五味子多糖对免疫抑制小鼠细胞因子分泌的影响  159-161
    8.2.7 五味子多糖对免疫抑制小鼠抗氧化功能的影响  161-162
  8.3 讨论  162-165
  8.4 结论  165-167
参考文献  167-188
附录  188-190
致谢  190-192
攻读学位期间发表论文  192-193

五味子多糖的分离、结构鉴定及免疫活性研究

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