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新型水仙生物碱Narciclasine影响植物根发育的特征及调控机理

作　者: 胡岩峰
导　师: 毕玉蓉
学　校: 兰州大学
专　业: 植物学
关键词: 生长素 生长素信号转导 生长素运输 胞吞作用 肌动蛋白微丝
分类号: Q946
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


天然产物Narciclasine (NCS)是一种从水仙鳞茎中提取的新型水仙生物碱,具生长与发育以及对环境刺激响应中发挥着关键作用。根据已有的研究成果和植物对NCS的一些特殊生理响应,推断NCS可能通过干扰生长素信号传导或生长素运输等进而影响了一些依赖生长素的生长发育过程。为此,本研究主要以模式植物拟南芥与水稻等为实验材料,对NCS影响依赖生长素的生长发育过程等问题进行深入研究。主要研究结果如下：1.NCS抑制了拟南芥根对生长素的生理响应。NCS通过干扰拟南芥根对外源生长素的敏感性进而抑制了生长素促进侧根及根毛的发育。与野生型相比,生长素信号突变体axrl-3和axrl-12的主根伸长对低浓度NCS的抑制作用表现出适度抗性,表明NCS可能间接影响了SCFTIR1/AFB泛素连接酶复合物介导的生长素信号传导。利用生长素响应GUS报告基因、生长素响应的天然型启动子基因.IAA12::GUS, IAA13::GUS及qRT-PCR检测发现,NCS对生长素响应基因的表达具有明显的抑制作用；ELASA检测结果表明NCS处理对拟南芥幼苗中的IAA含量没有产生明显影响,表明NCS并未影响生长素的生物合成。利用拟南芥HS::AXR3NT-GUS报告系分析发现NCS能够缓解SCFTIR1/AFB复合物介导的生长素诱导Aux/IAA蛋白的泛素化降解过程；生化实验结果表明,NCS对Aux/IAA蛋白稳定性的作用不是通过影响26S蛋白酶体的活性来实现；体外Pull-down结果表明,NCS处理并不能促进Myc-TIR1与IAA7/AXR2(Aux/IAA proteins)相互作用,说明NCS可能是通过改变SCFTIRl／AFB复合物某些上游元件进而对生长素信号产生抑制作用。综上所述,NCS抑制拟南芥根对生长素的响应可能是通过作用于生长素信号传导途径来实现。2.NCS通过调节生长素运输蛋白的表达进而影响生长素的运输。NCS处理能引起拟南芥幼苗的根失去向地性,这与生长素运输抑制TIBA和NPA处理后的特征类似。DR5::GUS报告基因检测结果显示NCS扰乱了拟南芥根尖生长素的正常分布;通过淀粉粒染色发现NCS处理影响依赖生长素的根冠小柱细胞的正常发育;在向重力刺激下,DR5-GFP报告系显微分析发现NCS抑制了生长素迅速向根尖底侧细胞中的迅速积累,这些结果说明NCS对根向地性及根尖生长素再分布的影响与生长素运输有关。BY-2细胞中[3H]IAA的积累实验表明NCS抑制了生长素运输载体介导[3H]IAA的内流及外流。利用包含PINs-GFP, AUX1-YFP融合蛋白的转基因拟南芥检测发现,NCS处理12h拟南芥根中生长素外流载体蛋白PINs和内流载体蛋白AUXl的表达丰度明显降低;qRT-PCR进一步分析发现NCS在转录水平也能调节生长素运输载体基因的表达,说明NCS在转录水平及蛋白水平均能调节生长素运输蛋白的表达。3.NCS影响了生长素载体蛋白的胞内转运。对生长素载体蛋白亚细胞定位分析发现,尽管NCS没有影响PINs及AUXl蛋白在细胞质膜上的定位,但是PIN2-GFP, PIN3-GFP, PIN4-GFP, PIN7-GFP和AUX1-YFP却在胞内迅速内化并形成蛋白聚集物,我们将这类蛋白聚集物称为“NCS小体”。利用标记囊泡的荧光染料FM4-64染色发现NCS促进了植物细胞的胞吞作用。将NCS处理过的PIN2-GFP幼苗进行FM4-64染色发现,以NCS小体形式存在的PIN2-GFP与FM4-64标记的囊泡发生部分重合,说明NCS通过细胞的胞吞作用诱导质膜上的生长素运输蛋白内陷到胞内形成蛋白聚集物。蛋白质合成抑制剂CHX和NCS共同处理的结果表明,NCS产生这种细胞效应独立于蛋白质的合成及新合成蛋白质向质膜的转运。NCS处理对BRIl-GFP、PIP2-GFP和GFP-LTI6b三种膜融合蛋白的膜定位及胞内转运未产生明显影响,说明NCS对膜蛋白的作用具有选择性。利用ARA7-GFP, NAG-GFP, SYP22-YFP和SYP61-CFP特殊的内膜系统标记系亚细胞定位分析发现,NCS对内膜系统的影响也具有选择性。此外,利用微丝骨架ABD2-GFP转基因系分析发现NCS处理后破坏了肌动蛋白微丝的结构,导致束状的蛋白微丝减少。通过对内体小泡标记蛋白ARA7-GFP的分析发现NCS处理后减缓了内体小泡的运输速率。4.NCS影响了水稻幼苗根系的发育。NCS抑制了水稻根的生长、减少了侧根数目,但是促进不定根的形成。进一步研究发现NCS明显抑制了外源生长素对水稻根系的促进作用,这与拟南芥中的研究结果类似,暗示NCS可能也影响了水稻中生长素运输及信号转导等过程。利用水稻DR5:GUS转基因系发现NCS明显干扰了生长素对DR5:GUS报告基因的诱导作用,说明NCS可能通过影响生长素信号传导过程抑制了水稻中生长素响应基因的表达。RT-PCR结果显示NCS能够影响水稻根中生长素运输基因的表达。通过对[3H]-IAA放射性检测发现NCS影响了水稻根中生长素向顶和向基的运输,这些结果表明NCS对水稻根中生长素运输也有影响。NCS处理引起水稻根呈螺旋状生长,我们推测可能是NCS影响生长素的运输使得其在水稻根中的分布改变所致。

全文目录


中文摘要  4-7
Abstract  7-11
縮写词  11-17
第一章 前言  17-46
  1.1 植物激素生长素的研究进展  17-38
    1.1.1 植物中生长素合成  17-20
    1.1.2 生长素的代谢  20-21
    1.1.3 生长素信号转导  21-28
    1.1.4 生长素运输  28-32
    1.1.5 植物细胞的囊泡运输  32-37
    1.1.6 植物细胞微丝骨架蛋白与囊泡运输  37-38
  1.2 石蒜科生物碱Narciclasine的研究进展  38-44
    1.2.1 石蒜科植物的生物学特性  38
    1.2.2 石蒜科植物生物碱的种类研究  38
    1.2.3 石蒜科生物碱的药理活性  38-39
    1.2.4 石蒜科生物碱的其他生物学活性  39-40
    1.2.5 NCS在动物中的研究进展  40-43
    1.2.6 NCS在植物中的研究概况  43-44
  1.3 本文的研究目的与意义  44-46
第二章 天然产物NCS抑制拟南芥根对生长素的响应  46-73
  2.1 引言  46-47
  2.2 材料与方法  47-55
    2.2.1 实验材料  47
    2.2.2 培养条件  47
    2.2.3 NCS的提取  47
    2.2.4 NCS、植物激素和化学抑制剂处理  47-48
    2.2.5 根的形态分析  48
    2.2.6 丙二醛含量测定  48
    2.2.7 碘化丙啶染色观察细胞膜完整性  48
    2.2.8 GUS染色  48-49
    2.2.9 GUS活性的定量分析  49
    2.2.10 Aux/IAA蛋白稳定性分析  49-50
    2.2.11 26S蛋白酶体活性检测  50
    2.2.12 Confocal显微分析  50
    2.2.13 体外GST Pull-Down实验  50-52
    2.2.14 酶联免疫吸附法(ELISA)测定IAA含量  52
    2.2.15 拟南芥根中总RNA提取  52-53
    2.2.16 实时荧光定量PCR分析  53-54
    2.2.17 数据分析及图像处理  54-55
  2.3 实验结果  55-69
    2.3.1 NCS影响了拟南芥根系统对生长素的生理响应  55-57
    2.3.2 NCS对生长素相关突变体根生长的影响  57-59
    2.3.3 NCS处理对拟南芥幼苗活性氧代谢的影响  59-60
    2.3.4 NCS对生长素响应基因表达的影响  60-64
    2.3.5 NCS抑制生长素所诱导Aux/IAA蛋白的降解  64-67
    2.3.6 NCS对26S蛋白酶体活性的影响  67
    2.3.7 NCS对SCF~(TIR1)和Aux/IAA蛋白相互作用的影响  67-69
  2.4 讨论与分析  69-73
第三章 NCS影响拟南芥根中生长素运输的作用机理研究  73-99
  3.1 引言  73-74
  3.2 材料与方法  74-76
    3.2.1 植物材料  74
    3.2.2 拟南芥幼苗暗处理  74
    3.2.3 植物激素和化学抑制剂对拟南芥幼苗的处理  74
    3.2.4 根的向重力性实验  74-75
    3.2.5 花粉管的体外培养及观察  75
    3.2.6 FM4-64染色及囊泡观察  75
    3.2.7 碘化丙啶染色  75
    3.2.8 Confocal显微分析  75
    3.2.9 BY-2细胞中[~3H]IAA积累实验  75-76
    3.2.10 拟南芥根中总RNA提取  76
    3.2.11 实时荧光定量PCR分析  76
    3.2.12 数据分析及图像处理  76
  3.3 结果分析  76-94
    3.3.1 拟南芥幼苗对NCS的生理响应  76-78
    3.3.2 NCS对拟南芥根尖生长素极性分布的影响  78-80
    3.3.3 NCS影响BY-2细胞对生长素的转运能力  80-81
    3.3.4 NCS对细胞膜上生长素载体蛋白表达的影响  81-82
    3.3.5 NCS从转录水平调节了生长素运输基因的表达  82-83
    3.3.6 NCS对细胞膜上生长素运输载体蛋白亚细胞定位的影响  83
    3.3.7 NCS对生长素载体蛋白胞内转运的影响  83-88
    3.3.8 NCS选择性地干扰了内膜转运途径  88-90
    3.3.9 NCS对依赖ARF-GEF途径的囊泡运输过程的影响  90-91
    3.3.10 NCS对ROP2/RIC4和ROP6/RIC1信号途径的影响  91-92
    3.3.11 NCS对细胞骨架蛋白的影响  92
    3.3.12 NCS对内体小泡运输速率的影响  92-94
    3.3.13 NCS抑制了细胞极性生长  94
  3.4 小结与讨论  94-99
第四章 水稻幼苗对NCS的生理响应  99-109
  4.1 引言  99-100
  4.2 材料与方法  100-102
    4.2.1 植物材料  100
    4.2.2 水稻培养条件  100
    4.2.3 NCS及生长素处理  100
    4.2.4 照片拍摄  100
    4.2.5 水稻根中总RNA提取  100-101
    4.2.6 RT-PCR分析  101
    4.2.7 GUS染色  101
    4.2.8 石蜡切片  101
    4.2.9 数据分析及图像处理  101-102
  4.3 结果与分析  102-108
    4.3.1 NCS对水稻种子萌发的影响  102-103
    4.3.2 NCS对水稻幼苗生长发育的影响  103-105
    4.3.3 NCS抑制了生长素对水稻根系发育的促进作用  105
    4.3.4 NCS对水稻根中DR5：GUS基因表达的影响  105-106
    4.3.5 NCS对水稻根中生长素运输基因表达的影响  106-107
    4.3.6 NCS对水稻根中生长素运输的影响  107-108
  4.4 小结与讨论  108-109
第五章 结论与展望  109-111
  5.1 主要研究结论  109-110
  5.2 展望  110-111
参引文献  111-130
在学期间研究成果  130-131
致谢  131

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中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物生物化学
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