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烟草靶斑病菌（Rhizoctonia solani AG-3）遗传多样性、定量检测技术及转录组学分析

作　者: 赵艳琴
导　师: 吴元华
学　校: 沈阳农业大学
专　业: 有害生物与环境安全
关键词: 烟草靶斑病菌遗传多样性 Real-time PCR定量分析转录组学
分类号: S432.4
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

烟草靶斑病(Rhizoctonia solani Kuhn)是一种严重影响烟草产量和品质的叶部病害,在许多国家造成了巨大的经济损失,国内2006年首次报道了该病害在丹东等地发生,迄今,国内外对烟草靶斑病菌相关研究较少,仅见本研究室对烟草靶斑病菌的生物学特性、遗传分化和致病机制等开展了基础性研究。为进一步探明烟草靶斑病菌的分子致病机制及病害流行规律,以期为该病害的防治提供理论依据,本文针对烟草靶斑病菌的致病类型、遗传多样性、定量检测和转录组学进行了系统深入研究,研究成果报道如下：1.明确了辽宁省烟草靶斑病菌存在着明显的生理分化现象,可划分为三个致病类型,即致病类型Ⅰ(强致病类型)、Ⅱ(中等致病类型)及Ⅲ(弱致病类型),以致病类型Ⅱ为优势种群,分析认为致病类型与菌株地区来源间没有明显相关性。对来源于不同地区的烟草靶斑病菌基因组ITS序列区进行了聚类分析,结果表各菌株间存在一定的差异,可将测试菌株分为两个ITS类群,进一步分析表明该类群划分与致病类型无明显相关性。2.建立并优化了适用于烟草靶斑病菌遗传多样性分析的SRAP反应体系,并对SRAP分组与菌株地区来源及致病类型间的关系进行了研究。选取多态性良好的初筛引物及优化后的反应体系对辽宁省烟草靶斑病菌进行PCR扩增,获得多态性条带743条,多态性百分比为98.4%,可将烟草靶斑病菌株划分为3个SGs类群；经分析SGs类群所表现出来的菌株基因组之间的多态性与菌株致病力相关,其中强致病类型菌株YC-9、YMC-2、LJT-8和DB-3都被聚合在SG I类群中,占SGI类群总数的66.7%；而弱致病力菌株LF-2、QYS-5和QYS-7都被聚合在SG Ⅱ类群。这表明SRAP分组与致病类型划分存在明显相关性,而与地区来源没有相关性；与不同融合群标准菌株分析比较表明,SRAP分组与融合群划分无明显相关性。国内外文献无此方面报道,本文为首次采用SRAP技术对烟草靶斑病菌致病类型及遗传多样性进行的研究。3.建立了烟草靶斑病菌的Real-time PCR定量检测体系,并应用该体系对烟草靶斑病进行早期定量检测,在接种侵染6h后便可检出YC-9菌株DNA,该体系也可以实时监测烟草靶斑病原菌在土壤中动态变化情况。参考NCBI数据库中R. solani不同融合群的ITS序列,设计了对R. solani AG-3特异的引物Rs TqF1/R4和探针QTqF1,并分别建立了适于检测烟草组织和土壤样品的Real-time PCR反应体系。应用该体系对接种烟草靶斑病菌的烟草叶片进行检测结果表明：在接种后6h后即可检测到烟草靶斑病菌,远早于接种36h后观察到可见病原菌子实体结构；采用该体系对各月发病烟田土壤样品定量结果表明：烟草靶斑病菌的群体随不同月份呈现动态变化趋势。自5月中下旬土壤中烟草靶斑病菌拷贝数逐渐升高,到6月28日达到最高,此后开始下降,到8月9日降到最低,8月末烟草靶斑病菌在土壤中拷贝数开始增加,直到1月21日达到最高,此后烟草靶斑病菌下降至4月份达到最低水平。本文为国内外首次建立并应用Real-time PCR技术对烟草靶斑病菌进行的定量检测研究。4.首次建立了烟草靶斑病菌转录组数据库,为分析烟草靶斑病菌的基因结构及其功能奠定了基础。采用转录组测序以及短序列组装,与烟草互作的T1靶斑病菌样品和未互作的T2对照样品经组装分别获得630125和562259个Contigs,N50值分别为96nt和104nt；经Transcripts组装后,T1和T2分别获得21206和20400条转录本序列,N50分别为1213bp和1247bp；最终共获得21779条Unigenes,平均长度为873nt,N50值为1339nt,较全面的获得了烟草靶斑病菌转录组数据库。5.通过对上述获得的烟草靶斑病菌转录组数据库的分析,首次对其Unigenes和差异表达基因进行了功能信息注释及代谢途径分析,进而从转录组水平阐明了烟草靶斑病菌的分子致病机理。采用Blastx软件比对全部Unigenes,其中14389条Unigenes被注释,与担子菌同源最高,其中包含植物病原担子菌T. cucumeris和R. solani等；经GO功能分类分析,共有5976条Unigenes被归类到48个功能类别中,其中生物代谢过程及催化活性和结合作用的分子功能最多；通过COG功能分类,共有5458条Unigenes被归类到25个功能类别中,其中预测功能,复制、重组和修复功能,碳水化合物运输和代谢功能的基因最多；经过KEGG代谢通路的分析,共有3820条基因被注释到158个信号通路中,其中注释到染色体通路、DNA修复和重组蛋白通路、剪接体通路、肽酶通路、泛素系统代谢通路和DNA复制蛋白中的基因较多。采用RPKM法进行差异表达基因分析,共获得827条差异表达基因,得到注释的有730条。通过GO和COG功能分类以及KEGG通路富集分析,差异表达基因多是参与蛋白质合成过程的相关基因,其中包括核糖体蛋白、转录因子、翻译因子、延伸因子等相关功能基因。

全文目录

摘要  8-10
Abstract  10-13
前言  13-14
第一章文献综述  14-24
  1.1 立枯丝核菌概述  14-17
  1.2 立枯丝核菌定量研究进展  17-21
  1.3 转录组学及转录组测序技术简介  21-23
  1.4 国内转录组学应用概况  23-24
第二章烟草靶斑病(Rhizoctonia solani)致病性及遗传多样性研究  24-51
  2.1 材料与方法  24-32
  2.2 结果与分析  32-48
    2.2.1 菌种采集及分离鉴定  32-33
    2.2.2 抗感性评价标准比较  33-34
    2.2.3 烟草靶斑病菌致病类型的划分  34-35
    2.2.4 烟草靶斑病菌的地区分布  35-36
    2.2.5 各菌株DNA的提取及检测  36
    2.2.6 烟草靶斑病菌ITS区分析  36-38
    2.2.7 烟草靶斑病菌SRAP遗传多样性分析  38-48
  2.3 小结  48-51
第三章烟草靶斑病菌的Real-time PCR定量检测技术及应用  51-79
  3.1 材料与方法  51-62
  3.2 结果与分析  62-76
    3.2.1 Real-time PCR反应引物及探针的设计  62-65
    3.2.2 Real-time PCR引物和探针特异性验证  65-67
    3.2.3 采用Real-time PCR技术早期定量检测烟草靶斑病菌  67-70
    3.2.4 Real-time PCR检测的土壤添加菌丝标准曲线的制作  70-73
    3.2.5 土壤中烟草靶斑病菌动态变化的监测  73-76
  3.3 小结  76-79
第四章烟草靶斑病菌转录组测序及数据库建立  79-91
  4.1 材料与方法  79-86
  4.2 结果与分析  86-90
    4.2.1 样品制备  86-87
    4.2.2 RNA的提取及质量检测  87-88
    4.2.3 测序结果统计  88
    4.2.4 组装结果统计  88-90
  4.3 小结  90-91
第五章烟草靶斑病菌转录组功能注释及差异分析  91-106
  5.1 材料与方法  91-92
  5.2 结果与分析  92-104
    5.2.1 Unigene结构注释  92-93
    5.2.2 DEG表达分析  93-94
    5.2.3 Unigene基因功能注释  94-97
    5.2.4 DEG基因功能注释  97-104
  5.3 小结  104-106
第六章结论与讨论  106-114
  6.1 明确了辽宁省烟草勒斑病菌的遗传多样性研究  106-108
  6.2 建立了烟草靼斑病菌的定量检测体系  108-110
  6.3 获得了烟草勒！斑病菌转录组序列  110-111
  6.4 烟草朝斑病菌转录组功能注释及差异分析  111-113
  6.5 本文创新点  113-114
参考文献  114-123
附录1  123-125
附录2  125-129
致谢  129-130
攻读博士学位期间发表的论文  130-132
论文图表统计  132

烟草靶斑病菌（Rhizoctonia solani AG-3）遗传多样性、定量检测技术及转录组学分析

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