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木糖发酵酵母Scheffersomyces stipitis的转录本测序、磷酸化蛋白质组及基因关联性分析

作　者: 袁铁铮
导　师: 范云六; 姚斌
学　校: 中国农业科学院
专　业: 生物化学和分子生物学
关键词: Scheffersomyces stipitis 木糖发酵转录本测序磷酸化蛋白质组基因关联
分类号: Q93
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

木质纤维廉价而且来源丰富,可以用于生产燃料乙醇,六碳糖(葡萄糖)和五碳糖(木糖)是木质纤维素中含量最多的两种组分,但是在工业上广泛应用的产乙醇微生物——酿酒酵母不能发酵五碳糖。在以葡萄糖或木糖为唯一碳源的培养条件下对木糖发酵酵母Scheffersomyces stipitis(树干毕赤酵母Pichia stipitis)进行转录本测序和定量蛋白质组研究,鉴定蛋白质磷酸化修饰,预测蛋白质相互作用,测定部分代谢物含量,并整合以上研究的数据进行基因关联性分析,获得可能作为木糖发酵的潜在调控点的关键基因(蛋白质)。转录本测序显示89%的ORFs的转录没有显著变化,214个基因存在差异表达,其中147个转录上调,67个转录下调,转录差异的基因主要编码参与糖代谢和氧化还原反应的蛋白。无标记定量蛋白质组分析鉴定4,085种蛋白质,在木糖和葡萄糖样品中表达上调蛋白质分别是1,551和789种,在木糖培养条件下,定位到糖酵解和三羧酸循环中的蛋白质丰度变化不大,戊糖磷酸途径、脂肪酸代谢的差异蛋白质大部分上调,该结果与转录组分析一致。磷酸化蛋白质组鉴定351个磷酸化蛋白质,包括982个磷酸化修饰位点,其中在色氨酸、苏氨酸或酪氨酸上的磷酸化修饰分别为477、328和177个,23和45种磷酸化修饰蛋白在葡萄糖或木糖样品中丰度增加,糖酵解、三羧酸循环和戊糖磷酸途径部分关键酶的磷酸化修饰受碳源影响。整合基因直系同源、基因本体论和基因共表达预测2,306个蛋白质形成26,528个相互作用对,进行聚类分析获得蛋白质互作网络中1类(51个)和2类(176个)的hub蛋白。基因关联分析显示S. stipitis在发酵葡萄糖或木糖时调控机制的多样化和复杂性,碳源影响糖酵解、三羧酸循环、戊糖磷酸途径、糖转运、糖的异生作用、氨基酸代谢、脂肪酸代谢、呼吸链、氧化磷酸化和转录调控等相关功能基因的转录或者蛋白的磷酸化修饰。提出一套S. stipitis功能基因组学研究的新型整体解决方案,自主开发的软件解决了相关专门分析工具缺乏的难题,与数据库一起实现数据整合和数据挖掘工作。提出改进的鉴定磷酸化修饰位点的算法Pscore并开发Perl软件包实现该算法,Pscore提取b-、y-、a-和亚氨离子等类型的离子碎片信息,考虑离子碎片所带电荷以及可以区分独特型的离子信息。S. stipitis转录组和蛋白质组的研究揭示了酵母在转录、翻译以及蛋白质翻译后修饰水平进行葡萄糖或木糖发酵调控过程的丰富信息,结合基因(蛋白质)的关联分析可以帮助我们缩小寻找影响木糖发酵关键基因的范围,减轻以后筛选目标基因进行遗传修饰的工作量,同时为阐述木糖发酵调控机制提供更多的线索。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-13
表索引  13-14
图索引  14-16
英文缩略表  16-18
第一章绪论  18-42
  1.1 燃料乙醇生产  18-23
    1.1.1 能源消耗与石油资源的矛盾  18-19
    1.1.2 生物质能源  19-20
    1.1.3 木质纤维素乙醇生产  20-23
  1.2 五碳糖的利用  23-28
    1.2.1 五碳糖发酵  24-25
    1.2.2 作为研究木糖发酵模式生物的S.stipitis  25-28
  1.3 高通量基因组学研究技术  28-38
    1.3.1 高通量测序技术  28-33
    1.3.2 蛋白质组学研究技术  33-38
  1.4 研究意义、目标和内容  38-42
第二章建立生物信息学分析平台  42-50
  2.1 方法  42-44
    2.1.1 硬件系统  42-43
    2.1.2 配置运算环境  43
    2.1.3 数据集  43-44
    2.1.4 构建数据库管理系统  44
  2.2 结果和讨论  44-49
    2.2.1 分析平台的硬件规划  44-45
    2.2.2 数据库结构  45-47
    2.2.3 结合数据库和R软件开发分析程序  47-49
  2.3 结论  49-50
第三章转录本测序和转录组分析  50-76
  3.1 材料和方法  50-57
    3.1.1 培养和处理酵母细胞  50-51
    3.1.2 提取总RNA和纯化mRNA  51-52
    3.1.3 构建cDNA文库和RNA-Seq测序  52
    3.1.4 RNA-Seq数据基因组作图和归一化处理  52-53
    3.1.5 发现新的转录本  53
    3.1.6 差异转录分析  53
    3.1.7 GO和代谢途径分析  53-54
    3.1.8 实时荧光定量反转录PCR  54-57
  3.2 结果和讨论  57-75
    3.2.1 细胞培养  57-59
    3.2.2 提取RNA  59
    3.2.3 RNA-Seq结果概述  59-63
    3.2.4 不同碳源下的转录组转录水平比较分析  63-65
    3.2.5 GO注释的比较分析  65-69
    3.2.6 转录本在染色体上的分布  69
    3.2.7 糖代谢  69-72
    3.2.8 qPCR验证RNA-Seq结果  72-75
  3.3 结论  75-76
第四章预测蛋白质相互作用  76-84
  4.1 方法  76-79
    4.1.1 提取酿酒酵母蛋白质相互作用信息  76
    4.1.2 酿酒酵母和S.stipitis本地BLASTP  76-77
    4.1.3 基于基因的直系同源预测蛋白质相互作用  77
    4.1.4 基于基因本体论注释预测蛋白质相互作用  77
    4.1.5 整合转录组数据预测蛋白质相互作用  77
    4.1.6 蛋白质互作网络中hub蛋白的聚类分析  77-78
    4.1.7 蛋白质相互作用网络分析  78-79
  4.2 结果和讨论  79-82
    4.2.1 酿酒酵母和S.stipitis比较基因组分析  79
    4.2.2 S.stipitis蛋白质相互作用  79-81
    4.2.3 S.stipitis蛋白质相互作用的hub蛋白分类和作用规律  81-82
    4.2.4 蛋白质相互作用倾向性分析  82
  4.3 结论  82-84
第五章无标记定量磷酸化蛋白质组研究  84-103
  5.1 材料和方法  84-89
    5.1.1 菌株和培养条件  84
    5.1.2 制备细胞总蛋白  84
    5.1.3 蛋白质分级沉淀和胶内酶切  84-85
    5.1.4 液内酶切和富集磷酸化多肽  85
    5.1.5 nanoLC-MS/MS质谱条件  85-86
    5.1.6 蛋白质数据库搜索和统计学分析  86-87
    5.1.7 蛋白质组的蛋白质丰度定量  87-88
    5.1.8 确定磷酸化修饰位点  88-89
  5.2 结果和讨论  89-101
    5.2.1 实验流程  89-90
    5.2.2 蛋白质鉴定和丰度定量分析  90-94
    5.2.3 提出改进的鉴定磷酸化修饰位点的算法Psco re  94-96
    5.2.4 鉴定潜在磷酸化修饰位点  96-100
    5.2.5 葡萄糖和木糖对磷酸化蛋白质磷酸化修饰水平的影响  100-101
  5.3 结论  101-103
第六章基因关联性分析  103-124
  6.1 方法  103-104
    6.1.1 测定游离氨基酸和脂肪酸含量  103
    6.1.2 提取KEGG代谢和蛋白质互作信息以及图形化展示  103-104
  6.2 结果和讨论  104-122
    6.2.1 参与糖利用的基因关联性分析  104-109
    6.2.2 呼吸链和氧化磷酸化  109-111
    6.2.3 参与氨基酸代谢的编码基因关联性分析  111-114
    6.2.4 参与脂肪酸β-氧化、细胞组成和合成乙醇的编码基因关联性分析  114-120
    6.2.5 S.stipitis的转录组和蛋白质组数据比较  120-122
  6.3 结论  122-124
第七章全文结论  124-128
  7.1 全文结论  124-126
  7.2 论文研究创新点  126-128
参考文献  128-134
附录(培养基和溶液的配制)  134-135
致谢  135-137
作者简历  137

木糖发酵酵母Scheffersomyces stipitis的转录本测序、磷酸化蛋白质组及基因关联性分析

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