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柠檬酸转运子和果胶甲酯酶在植物耐铝中的作用

作　者: 杨晓颖
导　师: 郑绍建
学　校: 浙江大学
专　业: 植物学
关键词: 耐铝柠檬酸转运子果胶甲酯酶饭豆水稻
分类号: X173
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

铝毒是限制酸性土壤上农作物生产的最主要的影响因子,植物的耐铝机制包括外部排斥和内部耐受,其中有机酸的分泌是植物重要的外部排斥机理,也是研究的热点。位于质膜上的有机酸转运子介导植物有机酸的分泌,是有机酸分泌的关键步骤。目前克隆到的有机酸转运子并不多,而且尽管有机酸分泌具有明显的A1诱导特征,但迄今还没有发现完全被铝诱导表达的有机酸转运子。我们实验室前期研究发现,A1胁迫可诱导饭豆根尖柠檬酸的分泌,且其分泌起始与施加A1胁迫之间有一个明显的滞后期。本研究通过同源克隆手段从饭豆中克隆得到了该柠檬酸转运子,并对其表达和功能进行了研究。另一方面,尽管有机酸的分泌是植物重要的耐铝机理,但不能解释水稻的铝耐性,本研究还以水稻为材料研究了果胶甲酯酶基因家族与铝诱导的根伸长受抑制间的关系。主要结果如下：1.从头合成的柠檬酸转运子VuMATE在饭豆铝耐性中的作用饭豆(Vigna umbellata)根系在铝胁迫下可专一性的分泌柠檬酸,并且分泌被延迟了数小时。本研究采用同源克隆和RACE技术从饭豆根尖中分离了一个从头合成(新合成)的柠檬酸转运子基因,由于其属于MATE基因家族的成员,将其命名为VuMATE。 VuMATE编码一个565个氨基酸的蛋白质。VuMATE与己知的柠檬酸转运子具有高度的序列相似性,都包含12个跨膜结构域,在跨膜域2和3之间都有一个位于细胞质中的环状结构,此结构也包含一段保守的氨基酸序列,推测其在柠檬酸转运方面具有重要作用。多序列比对显示,VuMATE与白羽扇豆的LaMATE亲缘关系最近。RT-PCR分析表明VuMATE在铝处理前没有表达,是第一个完全被铝诱导表达的有机酸转运子基因。VuMATE的表达部位仅限定在0-1cm根尖(铝毒的靶位),在1-2cm的根成熟区和叶片中都不表达。VuMATE的表达量随着A1处理浓度和处理时间的增加而增加,这与饭豆铝胁迫下根系柠檬酸的分泌模式相一致。VuMATE的表达不受二价金属Cd和Cu的诱导,三价金属La可以诱导VuMATE的表达,但同时加入A1会使表达量进一步提高。亚细胞定位显示VuMATE是一个膜蛋白。将VuMATE异源表达于爪蟾卵母细胞中的功能分析表明,VuMATE可以介导显著的跨越质膜的内向电流,内向电流的强度依赖于细胞外的H+离子(也可能是Na+)。注射14C标记的柠檬酸发现,VuMATE可以直接介导14C柠檬酸的转运,其转运能力也依赖于细胞外H+。通过转基因的方法在番茄中过表达VuMATE赋予了番茄分泌柠檬酸的能力,提高了番茄对铝的耐受性。所有这些结果说明VuMATE是饭豆中负责柠檬酸分泌的柠檬酸转运子。通过比较饭豆柠檬酸转运子与其它已知柠檬酸转运子的异同,发现了饭豆柠檬酸转运子具有不同于其它柠檬酸转运子的特点。2.水稻果胶甲酯酶基因与铝诱导的根伸长抑制相关水稻是小粒谷类中最耐铝的物种,但有机酸的分泌不能解释其强耐铝性,有研究表明铝主要和细胞壁果胶的负电荷结合,而果胶的负电荷的产生与果胶甲酯酶密切相关。为此,我们通过对水稻果胶甲酯酶基因家族的表达分析探讨了其与铝诱导根伸长抑制的关系。从DFCI数据库中下载了水稻果胶甲酯酶基因家族的35个成员,其cDNA序列的GC含量很高,每个成员具有不同的基因结构,所编码的蛋白质分为两组(一组只有PME结构域,一组在PME结构域前还有PMEI结构域),系统发生关系显示水稻果胶甲酯酶可以分为5类。当用25μM Al处理铝敏感水稻品种浙辐802("Zhefu802")3h,根伸长被抑制了40%,根尖细胞壁的PME活性提升了20%。这时,35个PME基因的表达变化分为4组：A组不表达,B组上调表达,C组下调表达,D组表达量不变。由于B组上调表达的8个PME基因与其酶活变化一致,我们初步认为这8个基因与铝诱导的根伸长抑制相关。我们进一步在铝耐性水稻品种日本晴("Nipponbare")中验证了筛选出的8个基因与铝胁迫的关系。结果表明：25μM Al处理3h不影响日本晴根伸长,此时,这8个基因的表达也不受影响；但当将Al处理浓度提高到50μM Al时,日本晴的根伸长受抑制也达到40%,此时,除了2个不表达的基因外,其它6个基因的表达都明显上调。由此,进一步证明了这8个基因与铝诱导的根伸长抑制相关。8个基因对其它金属胁迫的响应不同于铝胁迫,暗示着不同的PME基因对不同的金属胁迫做出响应。综上所述,我们从水稻果胶甲酯酶基因家族中筛选出了8个与铝诱导的根伸长抑制相关的基因,为从分子水平上研究细胞壁在抗铝胁迫中的作用提供了切入点。

全文目录

致谢  6-7
摘要  7-10
Abstract  10-14
縮略语表  14-15
目录  15-18
图表目录  18-19
第一章有机酸的分泌是植物重要的耐铝毒的机理  19-39
  1.1 引言  19
  1.2 植物的铝毒害  19-20
    1.2.1 植物铝毒害的症状  19-20
    1.2.2 植物铝毒害的作用位点  20
  1.3 植物的耐铝机理  20-21
  1.4 有机酸的分泌是植物重要的耐铝机理  21-30
    1.4.1 铝诱导不同植物有机酸的分泌  21-24
    1.4.2 有机酸分泌的两种模式  24
    1.4.3 苹果酸的分泌  24-26
    1.4.4 柠檬酸的分泌  26-29
      1.4.4.1 柠檬酸的体内代谢  26-27
      1.4.4.2 柠檬酸转运子及其调控  27-28
      1.4.4.3 控制柠檬酸分泌的其它调控因子  28-29
    1.4.5 草酸的分泌  29-30
  1.5 参考文献  30-39
第二章细胞壁在植物耐铝中的作用  39-52
  2.1 植物细胞壁组分及铝对细胞壁的影响  39-41
    2.1.1 植物细胞壁组分  39-40
    2.1.2 铝对细胞壁的影响  40-41
  2.2 果胶的甲酯化程度与铝耐性的关系  41-44
    2.2.1 果胶的甲酯化程度由果胶甲酯酶控制  41-44
    2.2.2 果胶的甲酯化程度与铝耐性  44
  2.3 半纤维素与铝耐性的关系  44-45
  2.4 问题的提出、技术路线及拟解决的关键问题  45-47
    2.4.1 问题的提出  45
    2.4.2 技术路线  45-47
    2.4.3 拟解决的关键问题  47
  2.5 参考文献  47-52
第三章饭豆柠檬酸转运子的基因克隆和生物信息学分析  52-59
  3.1 材料与方法  52-54
    3.1.1 植物材料和培养  52
    3.1.2 饭豆总RNA的提取  52
    3.1.3 同源克隆扩增基因片段  52-53
    3.1.4 RACE技术扩增基因全长  53-54
    3.1.5 VuMATE生物信息学分析  54
  3.2 结果  54-56
    3.2.1 饭豆柠檬酸转运子的基因克隆  54-56
    3.2.2 饭豆VuMATE的生物信息学分析  56
      3.2.2.1 多序列比对  56
      3.2.2.2 系统发生树分析  56
  3.3 讨论  56-58
  3.4 参考文献  58-59
第四章饭豆柠檬酸转运子VuMATE基因的表达分析和蛋白亚细胞定位  59-67
  4.1 材料与方法  59-62
    4.1.1 各种金属离子的处理  59
    4.1.2 RNA的提取和第一链cDNA的制备  59-60
    4.1.3 半定量RT-PCR分析VuMATE基因表达  60
    4.1.4 VuMATE::GFP融合载体的构建  60
    4.1.5 洋葱的预培养  60-61
    4.1.6 基因枪操作步骤  61
    4.1.7 GFP荧光观察  61-62
  4.2 结果  62-63
    4.2.1 VuMATE组织特异性表达及对不同金属离子的响应模式  62-63
    4.2.2 VuMATE蛋白的亚细胞定位  63
  4.3 讨论  63-65
    4.3.1 VuMATE完全被铝诱导表达  63-64
    4.3.2 VuMATE的表达仅限于柠檬酸的分泌位点  64-65
    4.3.3 VuMATE柠檬酸转运能力的发挥需要转录水平和蛋白水平的双重调节  65
  4.4 参考文献  65-67
第五章饭豆VuMATE的功能研究  67-79
  5.1 材料与方法  67-70
    5.1.1 饭豆培养和铝处理  67
    5.1.2 饭豆根系分泌物的收集和柠檬酸的测定  67
    5.1.3 VuMATE异源表达于爪蟾卵母细胞中的电生理研究  67-68
    5.1.4 载体构建及电转化至农杆菌  68-69
    5.1.5 农杆菌介导的番茄转化  69
    5.1.6 转基因植株的获得和分子鉴定  69
    5.1.7 相对根伸长  69-70
    5.1.8 番茄根系分泌物的收集和有机酸的测定  70
  5.2 结果  70-74
    5.2.1 铝胁迫下饭豆根系柠檬酸的分泌模式  70-71
    5.2.2 VuMATE介导的内向电流产生依赖于pH值  71-73
    5.2.3 VuMATE能够转运~(14)C-柠檬酸  73
    5.2.4 VuMATE转基因番茄的获得及与铝耐性相关生理指标的测定  73-74
  5.3 讨论  74-78
    5.3.1 VuMATE的柠檬酸转运能力依赖于H~+  74-75
    5.3.2 外源Al~(3+)间接调控VuMATE介导的柠檬酸转运  75-76
    5.3.3 通过转基因手段提高作物耐铝性的策略  76
    5.3.4 铝胁迫相关柠檬酸转运子的异同  76-78
  5.4 参考文献  78-79
第六章水稻果胶甲酯酶基因家族与铝胁迫引起的根伸长抑制的相关性研究  79-99
  6.1 材料与方法  80-83
    6.1.1 数据库搜索和序列分析  80
    6.1.2 植物材料和生长条件  80
    6.1.3 不同处理  80-81
    6.1.4 细胞壁的分离、PME的提取和PME活性分析  81
    6.1.5 SDS-PAGE和IEF电泳后的PME活性染色  81-82
    6.1.6 引物设计和基因表达分析  82-83
  6.2 结果  83-94
    6.2.1 细胞壁PME活性与铝诱导的根伸长抑制相关  83
    6.2.2 水稻PME基因家族的生物信息学分析  83-88
    6.2.3 铝敏感水稻品种浙辐802中OsPMEs的表达模式  88-89
    6.2.4 8个上调的OsPME基因在铝耐性水稻品种日本晴中的表达  89-93
    6.2.5 OsPMEs基因对其它金属胁迫的响应  93-94
  6.3 讨论  94-96
    6.3.1 水稻细胞壁PME活性增加与铝诱导的根伸长抑制相关  94
    6.3.2 PME活性增加与铝诱导根伸长抑制相关的可能作用机理  94-95
    6.3.3 受铝胁迫表现为相同表达模式的OsPMEs基因之间会有什么样的相似性?  95-96
  6.4 参考文献  96-99
第七章结论与展望  99-100
个人简历及博士期间发表的论文情况  100

柠檬酸转运子和果胶甲酯酶在植物耐铝中的作用

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