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抑制SMN2外显子7剪接的调控蛋白的鉴定和作用机制研究

作　者: 肖锐
导　师: 付向东; 张翼
学　校: 武汉大学
专　业: 生化与分子生物学
关键词: 可变剪接 SMN2外显子7 hnRNP U snRNA
分类号: R744
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

脊髓性肌萎缩症（Spinal Muscular Atrophy，SMA）是一种高发病率并导致婴儿致死的常染色体隐形神经肌肉障碍疾病。导致这种疾病的遗传学原因是纯和的丢失SMN1基因。但其同源的SMN2有外显子7上6位的C到T的突变导致其不剪接，产生截短的且不稳定的SMN蛋白，不能补偿全长的SMN蛋白的功能。所以说，增加SMN2外显子7的剪接目前被认为是可行、有效的方法来治疗脊髓性肌萎缩症。因此，SMN2外显子7的可变剪接调控的研究变得尤为重要。本论文通过初步的RNA干扰鉴定出了新的SMN2外显子7剪接的抑制因子-hnRNP U，同时还发现了hnRNP U的一项新功能-可变剪接调控因子，因为目前没有报道发现hnRNP U参与调控可变剪接。同时还发现它既调控SMN2外显子7剪接，也调控SMN1外显子7剪接，并不响应SMN2外显子7上C到T的突变位点。深入研究后发现重组的hnRNP U在体外并不结合SMN2外显子7和它附近的内含子RNA，但是在体内结合SMN2pre-mRNA。它的作用方式即不依赖于已知的内含子剪接抑制元件，也与该基因的转录速率无关。这暗示hnRNP U可能通过以前未被发现的方式调控SMN2外显子7可变剪接。为了进一步认识这种新的调控机制，我们引入了大规模筛选RNA结合蛋白的方法来寻找更多的调控因子，从其他340个左右的人类RNA结合蛋白基因中筛选SMN2外显子7的剪接抑制蛋白。推测其中有与hnRNP U相互作用的蛋白。我们发现5个参与3’剪接位点识别的组成型剪接正调控因子包括SF1，U2AF65，PUF60，U2AF35和CHERP（U2复合物成员）在SMN2外显子7可变剪接调控中均扮演抑制因子的角色。我们还发现hnRNP U和U2AF65，U2AF35和SF1相互作用，且这种相互作用依赖于RNA。该结果暗示hnRNP U和这些组成型剪接蛋白可能是是通过选择性促进组成型3’剪接位点的选择，而剪接抑制了可变外显子的选择。因此，当这些组成型剪接蛋白被敲低后，组成型3’剪接位点与可变3’剪接位点竞争它们共同的5’剪接位点的能力减弱了。为了进一步认识hnRNP U是通过那个RNA组成与U2AF65等组成型3’剪接位点相互作用的，我们采用了CLIP-seq方法全面获得hnRNP U基因组范围内的结合图谱，发现hnRNP U的确不直接结合SMN2上关键的外显子7及周围intron区域，却直接结合U2snRNA的SmBP-box区域。因此，hnRNP U可能通过参与U2snRNP的相互结合而被招募到组成型3’剪接位点的附近，与U2AF65相互作用。CLIP-seq数据显示hnRNP U结合在GU-富集的RNA基序上，而且结合位置与一些可变剪接调控事件紧密相关。暗示该蛋白可能是一个广泛的可变剪接调控蛋白。本论文已经获得了该蛋白表达和被siRNA沉默的宫颈癌细胞中的转录组，对数据的全面分析有望获得该蛋白调控宫颈癌细胞可变剪接的全貌。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-12
第一章引言  12-43
  1. 可变剪接调控的介绍  12-31
    1.1 前体 RNA 可变剪接  12-16
    1.2 剪接位点的识别和选择  16
    1.3 帮助剪接位点识别  16-19
    1.4 抑制剪接位点识别  19-21
    1.5 位置依赖性的剪接调控  21-22
    1.6 RNA 结构在可变剪接调控中的作用  22-23
    1.7 蛋白因子调控可变剪接  23-25
    1.8 转录偶联的可变剪接调控  25
    1.9 可变剪接和组织特异性  25-28
    1.10 组成型剪接调控因子调控可变剪接  28-29
    1.11 可变剪接与人类疾病  29-30
    1.12 展望  30-31
  2. SMA 和 SMN 的介绍  31-40
    2.1 SMA 疾病的介绍  31-35
    2.2 SMA 疾病相关的 SMN2 外显子 7 可变剪接的机制  35-38
    2.3 SMA 的治疗方面的进展  38-40
  3. hnRNP U 的介绍  40-41
  4. 本课题的研究内容及意义  41-43
    4.1 课题研究的内容  41-42
    4.2 课题的研究意义  42-43
第二章材料和方法  43-80
  1. 材料  43-49
    1.1 菌株、质粒及细胞系  43
    1.2 生化药品及来源  43-44
    1.3 细胞培养及操作相关的试剂  44
    1.4 酶类和 DNA marker，蛋白 marker  44-45
    1.5 抗体及其相关  45
    1.6 ssRNA 和 siRNA 合成  45-46
    1.7 本研究所用引物  46-48
    1.8 分析软件和网络资源  48
    1.9 图像编辑软件  48
    1.10 仪器  48-49
  2. 溶液的配制  49-52
    2.1 细菌用抗生素的配制  49
    2.2 蛋白纯化中所用的缓冲液  49-50
    2.3 DMEM 细胞培养基的配制  50
    2.4 细胞专用 PBS 的制备  50-51
    2.5 细胞专用胰酶的配制  51
    2.6 免疫沉淀及免疫印迹相关溶液的配方  51-52
  3. 方法  52-80
    3.1 E. coli RNase III 的制备和纯化  52-54
    3.2 人类 RNA 结合蛋白 esiRNA 库的制备  54-61
    3.3 细胞培养和转染  61-63
    3.4 免疫印迹  63
    3.5 RT-PCR  63-65
    3.6 Trizol 中提取蛋白  65
    3.7 突变克隆  65-66
    3.8 克隆的构建  66
    3.9 免疫共沉淀  66-67
    3.10 RIP-PCR  67
    3.11 免疫共定位  67-68
    3.12 CLIP-seq 实验流程及注意事项  68-78
    3.13 RNA-seq  78-80
第三章结果与讨论  80-97
  1. RNAi 筛选发现 HnRNP U 是一个新的抑制 SMN2 可变外显子 7 剪接的剪接调控因子。  80-83
  2．hnRNP U 沉默同样会增强 SMN1 的剪接，暗示 hnRNP U 不是通过靶向外显子 7 的 C 到 T 变化所产生的 ESS 而起作用的  83-85
  3. hnRNP U 抑制 SMN2 的剪接不依赖于任何已知的 ISS  85-86
  4. hnRNP U 可能不是通过影响转录延伸来抑制 SMN 外显子７的剪接的  86-87
  5. hnRNP U 在体外不与 SMN2 外显子 7 及附近的内含子 RNA 结合，而在细胞内结合 SMN2 转录本  87-88
  6. 大规模筛选人类 RNA 结合蛋白发现了另外 8 个新的抑制 SMN2 外显子 7 剪接的蛋白质，其中 5 个是与 U2 snRNP 相互作用的蛋白  88-91
  7. hnRNP U 与 U2AF65/35 通过 RNA 依赖的方式相互结合，并协同调控 SMN2 外显子 7 的剪接  91-92
  8. CLIP 鉴定 hnRNP U 结合的 RNA 靶标  92-94
  9. hnRNP U 结合 U2 snRNA，证明它是 U2 snRNP 的一个重要组分  94-97
第四章研究工作总结和展望  97-100
参考文献  100-114
研究生期间发表或待发表论文  114-115
致谢  115-116
缩写索引  116-117

抑制SMN2外显子7剪接的调控蛋白的鉴定和作用机制研究

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