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棉花抗逆相关基因GhDr1的克隆与功能分析

作 者: 丁忠涛
导 师: 张锐
学 校: 中国农业科学院
专 业: 作物遗传育种
关键词: 陆地棉 GhDr1 可变剪接 表达谱 亚细胞定位 生理实验
分类号: S562
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
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内容摘要


干旱、土壤盐碱化、气候异常导致的冷害热害等非生物逆境胁迫正严重影响着作物的产量和品质。植物在受到非生物逆境胁迫时能够通过自身的耐逆性减少非生物胁迫造成的伤害,这一过程是植物细胞受到非生物逆境信号刺激后,通过信号转导途径最终调动功能基因表达完成的。处于信号转导通路上蛋白表达量的变化会影响植物对逆境胁迫的耐受性。目前发现的MAPK、CDPK、CIPK等信号路径都涉及蛋白质磷酸化级联反应,将信号传递放大,以调控下游基因表达。通过基因工程的手段调控信号转导途径上基因的表达,来改良植物的抗逆性状具有广阔的前景。本研究在实验室克隆的棉花抗逆相关基因片段的基础上,进行了棉花抗逆相关基因的克隆及初步功能分析。取得的主要实验结果如下:1.在抗逆相关基因GhDr1的346bp基因片段基础上通过筛选基因组BAC文库,将GhDr1定位到单个BAC克隆子上;通过TAIL-PCR扩增得到GhDr1的5’端和3’端侧翼序列,最终获得GhDr1的7037bp基因组序列。通过RT-PCR结合TAIL-PCR扩增得到GhDr11913bp的cDNA序列。2.分析证明GhDr1含有4个外显子和3个内含子,转录起始位点位于ATG上游492bp处。GhDr1的第二内含子存在可变剪接现象,经可变剪接产生四种剪接异构体。剪接异构体对应的编码蛋白氨基酸序列中的差异肽段区域含有较多的可被磷酸化调节的丝氨酸和苏氨酸以及影响蛋白质二级结构的脯氨酸,这些差异导致了预测的磷酸化位点和二级结构发生变化。GhDr1的启动子区位于5’-UTR区及转录起始位点上游大约1.5kb的范围内,顺式作用元件分析证明GhDr1的启动子区存在许多逆境相关和信号转导相关调控元件。3.生物信息学分析发现:GhDr1的编码区全长1485bp,编码494个氨基酸残基,为稳定的带负电酸性蛋白质;GhDr1蛋白二级结构主要为α螺旋和无规则卷曲,分别占40.69%和44.94%; GhDr1的氨基酸序列中存在较多的亲水性氨基酸且存在集中的亲水区,没有明显的跨膜螺旋;亚细胞定位预测GhDr1定位于细胞质的可能性最大;同源性比对的结果表明GhDr1与蓖麻、葡萄、毛果杨和拟南芥的相关蛋白同源性最高;功能域预测发现GhDr1存在酪氨酸激酶II磷酸化位点、N-豆蔻酰化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、锌指类功能相关模块、MAPK磷酸化位点和MAPK相互作用位点; GhDr1在拟南芥和葡萄中的同源基因所处染色体区域有许多参与植物逆境反应和信号转导途径的功能蛋白。据此预测GhDr1可能在MAPK信号转导路径的磷酸化级联反应中被调节。4.表达谱分析表明GhDr1在棉花各生长发育时期器官中都有表达。棉花中GhDr1相对表达量最高的器官为成熟叶,根类组织胚根、幼根和成熟根中的表达量比较稳定,成熟期根、茎、叶和花中GhDr1表达量总体最高。5.构建好瞬时表达载体35S::35S::p16318-GhDr1-hGFP,通过基因枪转化洋葱表皮细胞进行瞬时表达。结果融合蛋白在洋葱表皮细胞中的荧光信号比较均匀地分布于胞质中,因此确定GhDr1为胞质蛋白。6.构建GhDr1基因的pBIGhDr1GUS植物双元表达载体,电击法转化农杆菌,蘸花法转化拟南芥得到转基因植株并改良了转化拟南芥的蘸花法,将其转化效率提高到40%左右。转基因植株经T1代抗性筛选、PCR鉴定、GUS染色鉴定和T2代、T3代分离比筛选最终鉴定转棉花GhDr1基因的拟南芥株系已经纯合。通过Real-Time PCR分析得到了2个超高表达、2个高表达和10个中低表达量的拟南芥纯合株系。7.选取有代表性的中低表达量株系38、62和高表达株系24及超高量表达株系61,结合WT和订购并已经鉴定纯合的相关突变体分析GhDr1的抗逆相关生理功能。生理实验结果显示:在正常的培养条件下转基因株系的表型好于野生型和突变体;在外源ABA平板上转GhDr1中低量表达株系不敏感而超高量表达株系敏感;在盐胁迫逆境下转GhDr1中低表达量拟南芥株系更敏感,而转GhDr1高表达株系不敏感;转GhDr1基因拟南芥株系在ABA平板上的萌发率高于野生型和突变体株系,在NaCl平板上的萌发率低于野生型及突变体株系。这说明GhDr1确实参与抗逆相关生理过程,而且其表达量的不同能够使转基因株系对非生物逆境胁迫的敏感性发生逆转。综上所述,本研究首次克隆了棉花抗逆相关基因GhDr1的基因组序列及启动子序列,发现了GhDr1至少产生四种剪接异构体;分析了GhDr1的表达谱和亚细胞定位特性;通过将GhDr1基因转入模式植物拟南芥过表达研究了转基因纯合拟南芥株系的抗逆相关生理表型,最终确定GhDr1参与抗逆相关生理过程。本研究对通过转基因的手段改良棉花的抗逆性能具有参考价值。

全文目录


摘要  6-8
Abstract  8-15
第一章 绪论  15-26
  1.1 文献综述  15-24
    1.1.1 植物抵御非生物逆境的分子机制  15-16
    1.1.2 参与植物非生物逆境信号转递的信号分子  16-20
    1.1.3 植物耐受非生物胁迫的三条信号转导途径  20-21
    1.1.4 植物抗逆相关MAPK 磷酸化级联途径  21-23
    1.1.5 植物抗逆基因工程研究进展  23
    1.1.6 植物基因的可变剪接现象  23-24
  1.2 本研究的内容和意义  24-25
  1.3 实验设计  25-26
第二章 棉花抗逆相关新基因GhDr1 及其启动子的克隆、可变剪接分析  26-45
  2.1 材料与方法  26-32
    2.1.1 实验材料  26-27
    2.1.2 方法  27-32
  2.2 GhDr1 的基因组序列获得  32-35
    2.2.1 筛选陆地棉Y18 基因组BAC 文库  32-33
    2.2.2 TAIL-PCR 获得未知基因片段的5’端侧翼序列  33-34
    2.2.3 TAIL-PCR 获得未知基因片段的3’端侧翼序列  34-35
  2.3 GhDr1 的cDNA 序列获得及可变剪接现象分析  35-41
    2.3.1 RT-PCR 和TAIL-PCR 获得GhDr1 的cDNA 序列  35-37
    2.3.2 GhDr1 的基因结构分析  37-39
    2.3.3 GhDr1 的可变剪接分析  39-41
  2.4 GhDr1 的启动子序列获得及分析  41-43
  2.5 讨论与小结  43-45
    2.5.1 讨论  43
    2.5.2 小结  43-45
第三章 GhDr1 的生物信息学分析  45-56
  3.1 方法  45-46
  3.2 GhDr1 的蛋白序列特征、二级结构分析  46-48
  3.3 GhDr1 的亲疏水性、亚细胞定位及潜在磷酸化位点预测  48-49
  3.4 GhDr1 的同源比对和系统进化树分析  49-51
  3.5 GhDr1 的功能预测  51-53
  3.6 讨论与小结  53-56
第四章 棉花中GhDr1 的表达谱及亚细胞定位  56-67
  4.1 材料与方法  56-60
    4.1.1 实验材料  56
    4.1.2 方法  56-60
  4.2 Real-Time PCR 分析GhDr1 在棉花各生长发育时期器官中的相对表达量  60-63
    4.2.1 热硼酸法及试剂盒法提取棉花各组织总RNA 比较  60-61
    4.2.2 GhDr1 在棉花中的表达谱分析  61-63
  4.3 GhDr1 的亚细胞定位分析  63-65
    4.3.1 GhDr1-GFP 融合表达载体的构建  63-65
    4.3.2 基因枪轰击洋葱表皮瞬时表达分析  65
  4.4 讨论与小结  65-67
第五章 转GhDr1 纯系拟南芥植株的获得  67-80
  5.1 材料与方法  67-72
    5.1.1 实验材料  67
    5.1.2 方法  67-72
  5.2 pBIGhDr1GUS 植物双元表达载体的构建  72-74
    5.2.1 中间表达载体的构建  72
    5.2.2 pBIGhDr1GUS 植物过表达载体的构建  72-74
  5.3 转化模式植物拟南芥  74-75
    5.3.1 电击法转化农杆菌LBA4404  74-75
    5.3.2 改良转化拟南芥的蘸花法  75
  5.4 转基因纯系植株的获得  75-77
    5.4.1 T1 代植株的PCR 鉴定、卡那抗性筛选和GUS 染色鉴定  75-77
    5.4.2 T2 代植株的分离比筛选  77
  5.5 Real-Time PCR 分析获得转GhDr1 的高表达及低表达植株  77-79
  5.6 讨论与小结  79-80
第六章 GhDr1 在转基因拟南芥中的抗逆相关生理功能分析  80-90
  6.1 材料与方法  80-81
    6.1.1 实验材料  80
    6.1.2 方法  80-81
  6.2 拟南芥At4G02210 基因T-DNA 插入纯合突变体的获得  81-83
    6.2.1 T2 代分离比筛选  82
    6.2.2 三引物法鉴定纯合突变体  82-83
  6.3 GhDr1 的抗逆相关生理实验  83-88
    6.3.1 未处理时转基因株系生长情况好于野生型  83-85
    6.3.2 转GhDr1 过表达拟南芥株系对外源ABA 敏感性分析  85
    6.3.3 转GhDr1 过表达拟南芥株系对盐胁迫敏感性分析  85-86
    6.3.4 转GhDr1 过表达拟南芥株系在ABA 平板上的萌发实验  86-87
    6.3.5 转GhDr1 过表达拟南芥株系在NaCl 平板上的萌发实验  87-88
  6.4 讨论与小结  88-90
    6.4.1 讨论  88
    6.4.2 小结  88-90
第七章 全文结论  90-92
  7.1 通过本论文研究得到的主要结论  90-92
参考文献  92-99
致谢  99-100
作者简历  100

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