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厚壳贻贝足丝蛋白分子多样性及重组表达分析

作　者: 李楠楠
导　师: 廖智
学　校: 浙江海洋学院
专　业: 海洋生物学
关键词: 厚壳贻贝足丝黏附蛋白多巴分子多样性蛋白质组重组表达
分类号: Q51
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

厚壳贻贝（Mytilus coruscus）是双壳类软体动物（bivalve mollusks），通过其足腺组织分泌的足丝，可在水环境下粘附于各种物体表面营固着生活。足丝（byssus）富含各种蛋白质成分，被称为贻贝黏附蛋白（Mussel adhesive protein， MAP），因具有极强的粘附性能而受到研究者们的重视。目前已鉴定到的贻贝足丝粘附蛋白有11种，包括足丝蛋白mfp-1~6，前胶原蛋白precol-D，precol-P，precol-NG，基质蛋白PTMP-1以及多酚氧化酶等。贻贝足丝粘附蛋白因具有防水性，生物相容性，非致敏性以及生物可降解性，可作为新型医用生物粘合剂进行应用开发，因而备受人们的关注。贻贝足丝蛋白的粘附性与其序列中DOPA（3，4-二羟基苯丙氨酸，多巴）分子有直接联系，为了解厚壳贻贝足丝黏附蛋白中DOPA含量及其粘附机理，利用氮蓝四唑（nitroblue tetrazolium， NBT）对DOPA的特异染色原理，结合蛋白质电泳，组织化学染色以及玻璃包被实验，分析了厚壳贻贝足丝盘和足丝纤维中DOPA的含量以及DOPA与厚壳贻贝足丝蛋白的粘附性能之间的关系。研究结果表明，厚壳贻贝足丝盘中蛋白的DOPA含量明显高于足丝，其粘附能力明显高于足丝纤维。除DOPA分子在厚壳贻贝足丝蛋白的粘附过程中发挥着重要作用外，贻贝不同足丝蛋白分子之间的相互作用和交联也是贻贝足丝具有较强粘附性的重要原因之一，但目前对于单种贻贝的足丝蛋白的分子多样性研究尚未见相关报道，为此，我们采用双向凝胶电泳技术（2-DE）结合质谱鉴定，分别对厚壳贻贝足丝纤维和足丝盘的蛋白质组成进行了分析，其中厚壳贻贝足丝纤维的共获得约20个蛋白质点，足丝盘样品的2-DE获得15个蛋白质点，研究结果表明，厚壳贻贝足丝纤维与足丝盘的蛋白质种类约35种左右，均表现为高丰度的碱性蛋白以及低分子量（<20kDa）的特征；利用质谱技术结合贻贝EST数据库搜索，对上述蛋白质点进行了初步鉴定，从中鉴定出mfp-3，mfp-6以及前胶原蛋白等已知足丝蛋白成分，此外还发现了三种新型的未曾报道的贻贝足丝蛋白。为深入了解厚壳贻贝足丝蛋白的分子多样性、探讨其粘附机理以及从中筛选具有应用前景的贻贝足丝蛋白奠定了基础。为获得足够量的贻贝足丝蛋白开展后续研究，我们分别开展了厚壳贻贝足丝粘附蛋白mfp-3和mfp-6的原核表达以及真核表达研究，均获得重组足丝蛋白表达产物，并对厚壳贻贝mfp-3重组表达产物进行了酪氨酸酶修饰研究。同时，我们根据数据库中加利福尼亚贻贝的mfp-5基因序列，设计特异性引物，以厚壳贻贝足腺细胞cDNA文库为模板，进行基因克隆，成功克隆到4种厚壳贻贝足丝粘附蛋白mfp-5的cDNA序列，为进一步开展了厚壳贻贝足丝粘附蛋白mfp-5的重组表达研究奠定基础。通过上述研究，一方面初步了解了厚壳贻贝足丝纤维和足丝盘中各种粘附蛋白的分子组成及特性，另一方面，通过表达载体并利用不同表达体系对厚壳贻贝mfp-3和mfp-6进行了重组表达，均获得了初步的成功，为厚壳贻贝足丝粘附粘附蛋白来源的新型生物粘合剂的开发奠定了基础。

厚壳贻贝足丝蛋白分子多样性及重组表达分析

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