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大肠杆菌血清抗体与硫酸庆大霉素偶联构建抗体靶向药物的研究

作　者: 董伟
导　师: 易自力
学　校: 湖南农业大学
专　业: 植物遗传工程
关键词: 大肠杆菌抗血清 抗体-药物结合物 仔猪黄痢病 硫酸庆大霉素
分类号: R978
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


近年来,治疗肿瘤的抗体药物研发取得了突破性的进展,抗体药物成为生物技术药物领域的热点之一。肿瘤抗体靶向药物主要是应用抗原抗体反应的原理构建肿瘤抗体药物,将治疗肿瘤的药物与抗体结合,构建“生物导弹”,对肿瘤实施生物疗法。而应用抗原抗体反应的原理构建抗菌药物,将抗菌药物与抗体结合,构建“生物导弹”,对病原菌实施“精确打击”的研究,却至今没有报道。为构建针对大肠杆菌的靶向性硫酸庆大霉素,本文进行了如下研究。1.大肠杆菌血清抗体与聚乙二醇和硫酸庆大霉素复合物的制备为了探讨大肠杆菌抗血清能否与硫酸庆大霉素结合,以及结合后是否会影响硫酸庆大霉素的药效和大肠杆菌血清抗体的生物学活性。本实验首先采用猪大肠杆菌灭活油乳佐剂苗,多次多部位背部皮下注射健康家兔,心脏采血,采集超免血清,用ELISA方法对抗猪大肠杆菌血清进行检测,其超免血清的抗体效价高达1:2048。然后对二者的结合条件进行摸索,以不同浓度的硫酸庆大霉素、免疫血清、PEG,建立方阵试验。收集各试验组血清抗体与硫酸庆大霉素结合产生的沉淀物进行聚丙烯酰胺电泳、革兰氏染色、电镜观察。结果发现,药物与血清抗体结合良好,以硫酸庆大霉素800（mL）:免疫血清4（μg）:PEG18（g）的结合量最大。因此,血清抗体与硫酸庆大霉素的结合具备有效性和可行性。2.大肠杆菌血清抗体与PEG6000和硫酸庆大霉素复合物结构研究为了探讨了结合物的结构,本实验对结合物进行了红外扫描和紫外吸收光谱测定,结果显示:结合物是以PEG6000为中间媒介。血清抗体与,硫酸庆大霉素先分别与PEG6000结合,从而形成血清抗体-PEG6000-硫酸庆大霉素复合物。结合的方式是氢键。PEG6000主要与血清抗体的酰胺键结合。3.大肠杆菌血清抗体与PEG6000和硫酸庆大霉素复合物的靶向性研究为了探讨结合物的靶向性,本实验对结合物进行间接ELISA、荧光染色和免疫电镜检测。间接ELISA结果表明:二者的结合对抗体的生物学活性和免疫学功能不会产生抑制作用;荧光抗体染色结果表明:硫酸庆大霉素、大肠杆菌血清抗体和PEG6000结合物具有大肠杆菌特异靶向性。硫酸庆大霉素、大肠杆菌血清抗体和PEG6000结合物与大肠杆菌菌液混合4min后,硫酸庆大霉素、大肠杆菌血清抗体和PEG6000结合物能与大肠杆菌结合。硫酸庆大霉素、大肠杆菌血清抗体和PEG6000结合物与大肠杆菌菌液混合7min后,硫酸庆大霉素、大肠杆菌血清抗体和PEG6000结合物能进入大肠杆菌菌体内;由胶体金免疫电镜结果中,在大肠杆菌的菌体内外均可见到胶体金颗粒,证明结合了药物的抗体的仍能高效与大肠杆菌作用,有较强的靶向作用。4.大肠杆菌血清抗体与PEG6000和硫酸庆大霉素复合物药动学检测及安全性评价本实验还探讨了结合物在动物体内的药动学并对其进行了安全性检测。结果表明:血清抗体-PEG6000-硫酸庆大霉素结合物在家兔体内的生物半衰期t1/2为4.83 h,药-时曲线下面积AUG为191.41 h.μg/mL,硫酸庆大霉素结合物在家兔体内的生物半衰期为t1/21.03 h,AUC为63.42 h.μg/ml,这表明血清抗体-PEG6000-硫酸庆大霉素结合物药代动力学及组织分布发生了明显变化,药物代谢速度大大减慢,有效血药浓度时间延长,与脂质体缓释剂的特点相似。由于血清抗体-PEG6000-硫酸庆大霉素结合物毒性很低,对小鼠的最大耐受量大于750mg/kg.bw,此量相当于临床用量的150倍。结果表血清抗体-PEG6000-硫酸庆大霉素结合物的毒性显著低于硫酸庆大霉素,表明血清抗体-PEG6000有降低药物毒性的作用。血清抗体-PEG6000-硫酸庆大霉素结合物对小鼠重要脏器的生长发育无明显影响。5.大肠杆菌血清抗体与PEG6000和硫酸庆大霉素复合物的药效学研究为了研究结合物的药效学,本实验应用结合物进行了体外抗菌试验、大肠杆菌病动物模型治疗试验。体外抑菌试验表明:靶向庆大霉素对大肠杆菌C44103的最低抑菌浓度约为硫酸庆大霉素的1/105。靶向硫酸庆大霉素对大肠杆菌C44103的最低杀菌浓度约为硫酸庆大霉素的1/104。体外抑菌实验说明将硫酸庆大霉素与大肠杆菌血清抗体和PEG6000结合后可增强抗菌效果,减少使用剂量,提高疗效。动物模型治疗试验表明:用高浓度靶向庆大霉素注射液每次肌注1.0mL/只,一次用药后的有效率、治愈率分别为100%和90%;用中等浓度靶向庆大霉素注射液每次肌注1.0mL/只,一次用药后的有效率、治愈率分别为100%和75%;用低浓度靶向庆大霉素注射液每次肌注1mL/只,一次用药后的有效率为100%,治愈率为65%。而硫酸庆大霉素对照组用硫酸庆大霉素注射液每次肌注1.0mL/只,后发病小白鼠治疗无效或全部死亡;血清对照组也治疗无效。靶向庆大霉素注射液对小白鼠大肠杆菌病疗效显著。复合物治疗仔猪黄痢临床治疗试验表明:靶向庆大霉素注射液能迅速杀死仔猪体内的致病菌,减轻临床症状,提高仔猪成活率。与硫酸庆大霉素相比较,用高剂量靶向庆大霉素注射液每次肌注2.0mg/Kg,一次用药后发病仔猪的有效率、治愈率均为100%;用中剂量靶向庆大霉素注射液每次肌注0.2mg/Kg,一次用药后发病仔猪的有效率为100%,治愈率为96%;用低剂量靶向庆大霉素注射液每次肌注0.02mg/Kg,两次用药后发病仔猪的有效率为96%,治愈率为92%;而用硫酸庆大霉素注射液每次肌注2.00mg/Kg,每天2次,连用3d后发病仔猪的有效率为84%,治愈率为76%;且用高剂量靶向庆大霉素注射液、中剂量靶向庆大霉素注射液、低剂量靶向庆大霉素注射液治疗的仔猪体内致病菌减少速度均要比硫酸庆大霉素注射液快得多。抗血清与庆大霉素结合物注射液能有效杀灭致病性大肠杆菌,对仔猪黄痢病有很好的临床疗效。复合物治疗鸡大肠杆菌病临床治疗试验表明:抗血清与庆大霉素复合物各剂量组给药1d,病鸡病症均明显减轻,高剂量组第2d鸡停止死亡,鸡的食欲和精神基本恢复;中剂量组治疗效果与高剂量组的治疗效果基本一致;低剂量组第2d鸡停止死亡,腹泻症状基本消失,鸡的食欲与精神状态第3d也基本恢复。硫酸庆大霉素组给药第2d症状开始减轻,到第4d腹泻症状基本消失,食欲和精神状态到第5d恢复。从上表数据可以看出:抗血清与庆大霉素结合物注射液高、中、低三种剂量对鸡大肠杆菌病疗效显著,有效率和治愈率分别为100%,100%,92%;100%,100%,90%。而硫酸庆大霉素组的有效率和治愈率分别为80%;70%。就症状变化情况看,抗血清与庆大霉素结合物各剂量组给药后腹泻症状改善速度和鸡的精神状态恢复速度较快,和硫酸庆大霉素组相比能更快地改善鸡腹泻症状和恢复鸡的精神状态。

全文目录


中文摘要  4-7
英文摘要  7-19
第一部分 文献综述  19-45
  第一章 抗体与靶向药物  19-29
    1.1 靶向性抗体  22-23
    1.2 药物  23-24
    1.3 抗体靶向药物所针对的疾病及其靶点设计  24-27
      1.3.1 肿瘤  24-27
      1.3.2 乙型肝炎  27
      1.3.3 炎症性肠病(IBD)  27
    1.4 问题与展望  27-29
  第二章 抗体与药物偶联方式及偶联物结构分析方法  29-43
    2.1 抗体靶向药物靶向释药机制  29
    2.2 抗体大分子与药物小分子偶联的方式  29-36
      2.2.1 抗体大分子与药物小分子直接作用  30
      2.2.2 抗体大分子与药物小分子通过小分子交联剂偶联  30-32
      2.2.3 抗体大分子与药物小分子通过大分子偶联物偶联  32-36
    2.3 抗体大分子与药物小分子非共价相互作用分析与检测方法  36-43
      2.3.1 光谱法  36-39
      2.3.2 电化学方法  39-40
      2.3.3 核磁共振分析法  40-41
      2.3.4 质谱法  41-42
      2.3.5 其它方法  42-43
  本研究的立项依据  43-45
    Ⅰ 技术路线  43-44
    Ⅱ 可行性分析  44-45
第二部分 研究报告  45-133
  第一章 大肠杆菌血清抗体与聚乙二醇和硫酸庆大霉素复合物的制备  45-60
    1.1 材料和方法  45-52
      1.1.1 材料  45-47
      1.1.2 方法  47-52
        1.1.2.1 分离及鉴定大肠杆菌  47-48
        1.1.2.2 大肠杆菌油乳剂灭活疫苗的制备  48-49
        1.1.2.3 制备大肠杆菌兔血清抗体  49
        1.1.2.4 纯化大肠杆菌血清抗体  49-50
        1.1.2.5 检测血清抗体的间接ELISA效价  50-51
        1.1.2.6 考马氏亮蓝法测定血清抗体含量  51
        1.1.2.7 选择抗体、聚乙二醇(PEG6000)和硫酸庆大霉素有效结合方法  51-52
        1.1.2.8 检测抗体、聚乙二醇(PEG6000)和硫酸庆大霉素结合及其稳定性  52
    1.2 结果与分析  52-57
      1.2.1 分离及鉴定大肠杆菌  52-53
        1.2.1.1 分离细菌  52-53
        1.2.1.2 鉴定分离菌  53
      1.2.2 制备及纯化大肠杆菌血清抗体  53-54
      1.2.3 大肠杆菌血清抗体间接ELISA效价  54
      1.2.4 大肠杆菌血清抗体含量  54-55
        1.2.4.1 牛血清白蛋白含量检测标准曲线  54-55
        1.2.4.2 大肠杆菌血清抗体含量  55
      1.2.5 大肠杆菌血清抗体与PEG6000和硫酸庆大霉素结合条件  55
      1.2.6 大肠杆菌血清抗体与PEG6000和硫酸庆大霉素复合物PAGE电泳  55-56
      1.2.7 大肠杆菌血清抗体与PEG6000和硫酸庆大霉素复合物革兰氏染色  56
      1.2.8 大肠杆菌血清抗体与PEG6000和硫酸庆大霉素复合物扫描电镜观察  56
      1.2.9 在4℃放置不同时间的大肠杆菌血清抗体与PEG6000和硫酸庆大霉素复合物扫描电镜观察  56-57
        1.2.9.1 4℃,30d大肠杆菌血清抗体与PEG6000和硫酸庆大霉素复合物稳定性  56
        1.2.9.2 4℃,90d大肠杆菌血清抗体与PEG6000和硫酸庆大霉素复合物稳定性  56
        1.2.9.3 4℃,180d大肠杆菌血清抗体与PEG6000和硫酸庆大霉素复合物稳定性  56-57
    1.3 讨论  57-59
    1.4 结论  59-60
  第二章 大肠杆菌血清抗体与PEG6000和硫酸庆大霉素复合物结构研究  60-86
    2.1 材料和方法  61-63
      2.1.1 材料  61-62
      2.1.2 方法  62-63
        2.1.2.1 复合物SDS-PAGE电泳  62
        2.1.2.2 红外扫描检测复合物结构  62
        2.1.2.3 紫外扫描检测复合物结构  62-63
    2.2 结果  63-81
      2.2.1 复合物SDS-聚丙烯酰胺电泳  63
      2.2.2 红外扫描复合物结构  63-71
      2.2.3 紫外扫描复合物结构  71-81
    2.3 讨论  81-84
    2.4 结论  84-86
  第三章 大肠杆菌血清抗体与PEG6000和硫酸庆大霉素复合物的靶向性研究  86-96
    3.1 材料和方法  86-90
      3.1.1 材料  86-87
      3.1.2 方法  87-90
        3.1.2.1 检测复合物的间接ELISA效价  87
        3.1.2.2 制备菌液  87-88
        3.1.2.3 间接免疫荧光检测复合物靶向性  88
        3.1.2.4 胶体金免疫电镜检测复合物靶向性  88-90
    3.2 结果与分析  90-92
      3.2.1 复合物与大肠杆菌抗血清抗体间接ELISA效价  90
      3.2.2 复合物免疫荧光  90-91
        3.2.2.1 复合物和大肠杆菌血清杭体与大肠杆菌菌液混合液的免疫荧光  90-91
        3.2.2.2 复合物与链球菌、巴氏杆菌、金葡菌和大肠杆菌菌液混合液的免疫荧光  91
      3.2.3 复合物免疫电镜观察  91-92
        3.2.3.1 大肠杆菌切片电镜扫描  91-92
        3.2.3.2 胶体金标记的结合物与大肠杆菌菌液混合后切片电镜扫描  92
        3.2.3.3 大肠杆菌血清抗体与大肠杆菌菌液混合后切片电镜扫描  92
    3.3 讨论  92-94
    3.4 结论  94-96
  第四章 大肠杆菌血清抗体与PEG6000和硫酸庆大霉素复合物药动学检测及安全性评价  96-113
    4.1 材料与方法  96-100
      4.1.1 材料  96-97
        4.1.1.1 药物  96
        4.1.1.2 酶标抗体  96
        4.1.1.3 实验动物  96
        4.1.1.4 间接ELISA溶液和试剂  96-97
      4.1.2 方法  97-100
        4.1.2.1 建立复合物中硫酸庆大霉素含量检测方法  97-98
        4.1.2.2 测定复合物的药动学  98
        4.1.2.3 安全性评价  98-100
    4.2 结果与分析  100-107
      4.2.1 硫酸庆大霉素标准品紫外扫描  100-101
      4.2.2 硫酸水解法检测硫酸庆大霉素含量检测标准曲线  101-102
      4.2.3 硫酸水解法结合物中硫酸庆大霉素含量检测标准曲线  102
      4.2.4 家兔血液中的硫酸靶向硫酸庆大霉素质量浓度  102-104
      4.2.5 复合物安全性  104-107
        4.2.5.1 复合物的急性毒性  104
        4.2.5.2 复合物的亚慢性毒性  104-106
        4.2.5.3 复合物的免疫原性  106-107
    4.3 讨论  107-112
    4.4 结论  112-113
  第五章 大肠杆菌血清抗体与PEG6000和硫酸庆大霉素复合物的药效学研究  113-133
    5.1 材料和方法  115-122
      5.1.1 材料  115-116
      5.1.2 方法  116-122
        5.1.2.1 检测复合物体外抗菌效果  116-117
        5.1.2.2 复合物大肠杆菌病动物模型治疗  117-118
        5.1.2.3 应用复合物治疗猪和鸡的大肠杆菌病  118-122
    5.2 结果与分析  122-127
      5.2.1 复合物体外抗菌效果  122-123
        5.2.1.1 复合物体外抑菌效果  122
        5.2.1.2 复合物体外杀菌效果  122-123
      5.2.2 复合物大肠杆菌病动物模型治疗  123-124
        5.2.2.1 大肠杆菌LD_(50)  123
        5.2.2.2 复合物大肠杆菌动物模型治疗  123-124
      5.2.3 复合物治疗大肠杆菌病  124-127
        5.2.3.1 大肠杆菌病间接荧光诊断方法  124-125
        5.2.3.2 复合物治疗仔猪黄痢  125-126
        5.2.3.3 复合物治疗鸡大肠杆菌病  126-127
    5.3 讨论  127-131
    5.4 结论  131-133
本研究的总结和创新点  133-135
  1 研究总结  133-134
  2 本研究的创新点  134-135
参考文献  135-147
图版  147-158
致谢  158-159
作者简历  159
在读期间发表的主要论文  159

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药品 > 治疗传染病及寄生虫病药物
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