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甲烷氧化菌的微生态解析及其应用基础研究

作　者: 韩冰
导　师: 邢新会
学　校: 清华大学
专　业: 化学工程与技术
关键词: 甲烷氧化菌 甲烷单加氧酶 分子生态学 异源表达 高密度培养
分类号: Q93
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


甲烷氧化菌及甲烷单加氧酶(MMO)在生物转化、生物修复和温室气体CH4的减排等方面具有重要的应用价值。本论文围绕甲烷氧化菌及MMO在应用过程中存在的问题:1)催化氧化过程受辅酶NADH再生的限制;2)甲烷氧化菌生长速度慢、细胞密度低,难以满足工业生物催化的需要;3)可以工业应用的甲烷氧化菌资源有限,MMO外源表达技术不成熟,利用微生物分子生态学、基因工程、生物工程等手段对甲烷氧化菌在我国煤矿土壤中的分布、MMO蛋白的异源表达、甲烷氧化菌的高密度培养及其催化氧化丙烯的过程进行了研究。利用稳定性同位素探针、生物芯片等多种分子生态学方法解析我国典型瓦斯煤矿土壤中甲烷氧化菌群落的组成和活性。?型与II型甲烷氧化菌均存在于该碱性煤矿土壤中。首次报道了煤矿中甲烷氧化菌的组成,为进一步分离具有特殊功能的甲烷氧化菌和建立用于吸收煤矿瓦斯气的生物过滤器提供帮助。利用Trial andError的方式对颗粒性甲烷单加氧酶(pMMO)异源表达技术进行了系统的研究,通过对启动子、表达载体及表达宿主的比较和选择,初步建立了异源表达pMMO的研究平台和方法。构建了由烷烃单加氧酶启动子调控pmoCAB的pCompmo质粒,在重组产气肠杆菌中实现了pMMO的转录、翻译,但由于pMMO在折叠过程受到其它因素影响,不能稳定得到正确组装的蛋白。利用pMMO原始启动子构建了含有pmo完整基因簇的pCHP质粒,并转入大肠杆菌中,首次实现了pmo完整基因簇在大肠杆菌中的克隆。以甲烷氧化菌Methylosinus trichosporium OB3b为对象,石蜡油作为甲烷传递体可以极大的缩短细胞生长的迟滞期,促进细胞快速、高密度生长。在5L发酵罐中,石蜡油浓度为5%时,干重高于9.89gL-1,为无石蜡油添加时的4.5倍。以M. trichosporium OB3b整细胞催化丙烯制备环氧丙烷为例,对甲烷氧化菌应用于工业催化进行了基础的研究。当以OD660为8的细胞进行催化氧化时,反应22小时,产物环氧丙烷最高浓度可达到12.2mM。同时发现发酵液直接用于催化反应,可以减少传统两步法的工序,缩短“生长与催化”周期。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-13
第1章 文献综述  13-39
  1.1 课题背景  13-15
  1.2 甲烷氧化菌及甲烷单加氧酶  15-22
    1.2.1 甲烷氧化菌的代谢途径及分类  16-19
    1.2.2 MMO 的基因与蛋白结构  19-21
    1.2.3 MMO 的调控机制  21-22
  1.3 甲烷氧化菌及甲烷单加氧酶的应用前景  22-26
    1.3.1 在生物修复中的应用  23-24
    1.3.2 在甲烷排放控制中的应用  24-25
    1.3.3 在工业生物催化中的应用  25-26
    1.3.4 其它方面的应用  26
  1.4 甲烷氧化菌及甲烷单加氧酶的研究前沿  26-35
    1.4.1 甲烷氧化菌的培养工艺研究  27
    1.4.2 甲烷氧化菌及MMO 的工业生物催化研究  27-30
    1.4.3 甲烷氧化菌及MMO 的基因工程研究  30-32
    1.4.4 甲烷氧化菌的生态学研究  32-35
  1.5 甲烷氧化菌及甲烷单加氧酶在工业应用中存在的问题  35-36
  1.6 论文的主要研究内容  36-39
    1.6.1 本论文的主要研究内容  36-37
    1.6.2 本论文的研究框架  37-39
第2章 碱性煤矿甲烷氧化菌群落的分子微生态学解析  39-68
  2.1 引言  39-41
  2.2 实验方法  41-45
    2.2.1 DNA 提取和纯化  41
    2.2.2 稳定性同位素探针标记  41-42
    2.2.3 PCR扩增16S rRNA和功能基因  42-43
    2.2.4 克隆文库的核酸限制性片段长度多态性分析  43-44
    2.2.5 变性梯度凝胶电泳  44
    2.2.6 DNA 芯片分析  44
    2.2.7 DNA 测序及进化树分析  44
    2.2.8 核酸序列  44-45
  2.3 煤矿概况及其土壤的特性分析  45-47
  2.4 煤矿土壤中甲烷氧化菌群落的功能基因解析  47-57
    2.4.1 基于功能基因pmoA 的RFLP 分析和生物芯片分析  47-52
    2.4.2 基于功能基因mmoX 的RFLP 分析  52-54
    2.4.3 基于功能基因mxaF 的RFLP 分析  54-57
  2.5 煤矿土壤中活性甲烷氧化菌群落的解析  57-66
    2.5.1 DNA-SIP 标记煤矿土壤和~(13)C-DNA 的分离  57-58
    2.5.2 基于16S rRNA 的RFLP 分析和 DGGE 分析  58-62
    2.5.3 基于pmoA 的 RFLP 分析和生物芯片分析  62-65
    2.5.4 基于mxaF 的 RFLP 分析  65-66
  2.6 本章小结  66-68
第3章 颗粒性甲烷单加氧酶的异源表达研究  68-94
  3.1 引言  68-71
  3.2 实验材料与方法  71-76
    3.2.1 菌株及质粒  71-72
    3.2.2 培养基及培养条件  72-73
    3.2.3 质粒提取  73-74
    3.2.4 PCR 扩增相应DNA 片段  74
    3.2.5 质粒转化方法  74
    3.2.6 基因工程菌的pMMO 转录分析  74-75
    3.2.7 基因工程菌的翻译分析  75
    3.2.8 基因工程菌的催化活性分析  75-76
  3.3 编码pMMO 基因簇的T-A 克隆  76-79
    3.3.1 pmo 基因簇的扩增和验证  77-78
    3.3.2 PCR 产物T-A 克隆及测序分析  78-79
  3.4 利用外源启动子调控pmoCAB 基因的外源表达研究  79-87
    3.4.1 利用pUC18 载体及 Plac启动子表达pmoCAB 的研究  79-80
    3.4.2 利用pCom10 载体及 PalkB启动子表达pmoCAB 的研究  80-87
  3.5 利用pMMO 原始启动子调控pmoCAB 基因的外源表达研究  87-93
    3.5.1 pCHP 质粒表达载体的构建  87-88
    3.5.2 连接产物的转化及筛选  88-90
    3.5.3 pCHP 质粒在产气肠杆菌、假单胞菌中的性质  90-93
  3.6 本章小节  93-94
第4章 石蜡油强化 M. trichosporium OB3b 培养的研究  94-112
  4.1 引言  94-96
  4.2 实验材料与方法  96-99
    4.2.1 菌株  96
    4.2.2 培养基及培养条件  96-97
    4.2.3 5L发酵罐培养M. trichosporium OB3b  97-98
    4.2.4 M. trichosporium OB3b的OD_(660)与细胞干重的关系  98
    4.2.5 M. trichosporium OB3b的酶活分析  98-99
  4.3 摇瓶培养条件下石蜡油强化M. trichosporium OB3b生长的 研究  99-102
    4.3.1 甲烷在不同有机溶液中的溶解度  100-101
    4.3.2 石蜡油浓度对M. trichosporium OB3b生长的影响  101-102
  4.4 5L发酵罐中石蜡油强化M. trichosporium OB3b生长的研究  102-105
  4.5 石蜡油强化M. trichosporium OB3b 生长机理的探讨  105-111
    4.5.1 发酵体系中的石蜡油与菌体的相互作用  105-109
    4.5.2 发酵体系中的石蜡油对菌体活性的影响  109-111
  4.6 本章小节  111-112
第5章 M. trichosporium OB3b 催化氧化丙烯制环氧丙烷的研究  112-130
  5.1 引言  112-113
  5.2 实验材料与方法  113-114
    5.2.1 1,2-环氧丙烷标准曲线  113-114
    5.2.2 M. trichosporium OB3b 催化反应  114
  5.3 M. trichosporium OB3b 整细胞催化特性研究  114-118
    5.3.1 热稳定性  114-116
    5.3.2 最适反应温度  116-118
  5.4 缓冲溶液体系中整细胞催化氧化丙烯制环氧丙烷的优化  118-121
    5.4.1 丙烯初始浓度对环氧丙烷积累浓度的影响  118-119
    5.4.2 磷酸缓冲溶液中甲酸钠浓度对环氧丙烷积累浓度的影响  119-120
    5.4.3 磷酸缓冲溶液中MgCl_2浓度对环氧丙烷积累浓度的影响  120-121
  5.5 利用高密度发酵细胞催化氧化丙烯生制环氧丙烷的研究  121-125
    5.5.1 细胞浓度对环氧丙烷积累浓度的影响  122-123
    5.5.2 催化反应时间对环氧丙烷积累浓度的影响  123-125
  5.6 发酵液直接催化丙烯生成环氧丙烷  125-128
    5.6.1 不同发酵阶段细胞浓度对环氧丙烷积累浓度的影响  126-127
    5.6.2 催化反应时间对环氧丙烷积累浓度的影响  127-128
  5.7 本章小结  128-130
结论  130-133
参考文献  133-147
致谢  147-148
附录A 主要实验仪器及试剂  148-151
  一 实验仪器  148-149
  二 化学试剂  149-150
  三 基因操作酶和试剂盒  150-151
附录 B 质粒pCHP 中pmo 基因簇 DNA 序列  151-155
个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果  155-156

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中图分类: > 生物科学 > 微生物学
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