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细胞内功能性活性物种（自由基、金属离子）的新型荧光探针的设计合成及其可视化成像分析

作　者: 李平
导　师: 唐波
学　校: 山东师范大学
专　业: 植物学
关键词: 活性物种脂质氢过氧化物与羟基自由基亚铁离子荧光探针荧光显像可视化
分类号: Q503
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

动植物体内存在着大量的微量或痕量的活性物种(自由基、金属离子),它们对生命过程具有着重要的影响,具有特殊的生理功能。它们既是生物体所必需的物质,但在某些环境(如胁迫)下又会给生物体带来损伤。如果想要详细了解它们的生物学功能,就必需能够及时准确地对其进行检测。但又由于生物成分本身的多样性、复杂性,对这些微量生物分子的研究就必须采用专一选择性、高灵敏度的分析方法。因而发展选择性好、灵敏度高的分子荧光探针,对动、植物活体细胞中的活性物种动态、原位可视化成像分析是目前生命科学研究的重要热点领域之一。在活性物种中,活性氧(ROS, Reactive Oxygen Species)自由基中的脂质氢过氧化物(ROOH)一直受到人们的广泛关注,脂质氢过氧化物出现在脂质过氧化的早期,并迅速降解成烷烃、羰基化合物等产物,对它的准确检测能够为脂质过氧化过程的研究提供有利的证据;羟基自由基(·OH)是生命新陈代谢过程产生的活性氧中,目前已知氧化性最强的自由基,它进攻产生位点的蛋白质、脂质和DNA,进而引发次级的自由基反应,导致无法修复的细胞损伤;因此开展ROOH与·OH动态、原位检测不但是生命科学研究所迫切需求的,同时也是化学研究中的热点与难点。此外,铁是生物体所必需的金属元素,但是研究发现,细胞内的螯合的铁被认为对多种细胞损伤是一个决定性的致病因子,尤其是细胞胞浆内痕量的亚铁离子能够催化Fenton反应,产生氧化性极强的羟基自由基;如果想要对Fe2+的生物学功能深入的了解,就必需发展出高选择性、高灵敏度的新型检测方法。本论文为了高选择性、高灵敏度快速识别和检测动植物细胞内脂质氢过氧化物、羟自由基和亚铁离子,开展了以下三个方面的研究工作:(一)设计合成了一种含有非共轭“前花菁”的新型近红外荧光探针TCP(tricarbocyanine diphenylphosphine),用于活细胞中脂质氢过氧化物的“可视化”。脂质氢过氧化物对探针中的含磷五元环进行亲核取代反应,导致五元环打开,从而恢复花菁的共轭结构,产物具有强荧光。探针的荧光激发和发射最大波长都位于近红外区,能够有效地避免生物系统中背景荧光的干扰,探针对脂质氢过氧化物能够高选择性地快速响应,而且不受其他活性氧和一些生物体内物质的影响,分析方法的检测限为38 pM。结合共聚焦荧光显像,探针还实现了脂质氢过氧化物在活的巨噬细胞、正常的人体肝细胞和肝癌细胞中的“可视化”。此外,通过MTT毒性实验证明探针是低细胞毒性,而且探针的性质相当稳定,结果为动、植物其它细胞中脂质氢过氧化物的分析提供了理想的探针与分析方法。(二)基于顺磁性的哌啶醇氮氧自由基(TEMPO)与荧光团BODIPY之间分子内电子交换导致其荧光猝灭的机理,将TEMPO与BODIPY通过共价键结合起来,设计合成了一种新型荧光探针TEMPO-BDP以检测生物体系内的羟基自由基。检测的原理是羟基自由基能够与DMSO快速反应生成甲基自由基,探针与甲基自由基结合后的产物发出强荧光。在模拟生物体系中,探针能够迅速地、高选择性地对羟基自由基进行定量检测,分析方法的灵敏度高,检测限为18 pM。探针还被成功地应用于未经PMA刺激和经过PMA刺激的活的小鼠巨噬细胞中,对所产生的羟基自由基进行了特异性的识别检测,实现了羟基自由基在活细胞内的“可视化”,并且证明了探针的低细胞毒性。此外,探针还分别对正常的和博莱霉素诱导产生肺组织纤维化的以及治疗后的大鼠的胸腔灌洗液,进行了羟基自由基的有效测定,从而证明了该探针是动、植物样品及细胞中·OH检测的理想探针。(三)本论文设计合成了一种连有两个噻吩的BODIPY结构的荧光分子探针DT-BDP用于检测Fe(Ⅱ),探针本身有强的荧光,与Fe2+配位络合后,导致BODIPY的荧光猝灭,荧光强度的猝灭与Fe2+的浓度成比例关系,反应前后探针由蓝色变为绿色,而且探针对Fe2+有高选择性,很有希望能够适用于植物细胞胞浆内的可变,以及比较复杂的生物体系内亚铁离子的特异性识别与检测。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-10
第一章绪论  10-43
  1 活性氧自由基  10-30
  2 铁离子的生物学功能及其检测方法  30-34
  3 论文选题的目的与意义  34-36
  参考文献  36-43
第二章一种检测活细胞内脂质氢过氧化物的新型近红外荧光探针  43-73
  1. 引言  43-45
  2. 实验部分  45-50
  3. 结果与讨论  50-69
  参考文献  69-73
第三章用于检测活巨噬细胞中羟基自由基的新型荧光探针  73-97
  1. 引言  73-76
  2. 实验部分  76-81
  3. 结果与讨论  81-94
  参考文献  94-97
第四章用于检测Fe（Ⅱ）的新型荧光探针的设计合成及其分析应用  97-111
  1. 引言  97-99
  2. 实验部分  99-102
  3. 结果与讨论  102-109
  参考文献  109-111
作者发表的学术论文、专利及参与课题  111-114
致谢  114

细胞内功能性活性物种（自由基、金属离子）的新型荧光探针的设计合成及其可视化成像分析

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