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细胞电穿孔机理分析及电穿孔在肿瘤治疗中的应用

作　者: 张弘
导　师: 黄卡玛
学　校: 四川大学
专　业: 通信与信息系统
关键词: 电穿孔电脉冲电化学疗法肿瘤治疗电场分布机理分析
分类号: R730.5
类　型: 博士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

细胞电穿孔是指细胞在外加电场的作用下，细胞膜磷脂双分子层上形成微孔，使细胞膜的通透性增强的生物物理过程。当细胞膜发生电穿孔时，离子、亲水分子、病毒颗粒、DNA、蛋白质以及药物颗粒等正常情况下不能通过细胞膜的大分子得以进入细胞。将细胞电穿孔技术运用于肿瘤治疗是细胞电穿孔的众多应用中的一项重要应用。利用电脉冲和化疗药物相结合进行肿瘤治疗的方法称为电化学疗法，这种疗法是基于对肿瘤施加电脉冲导致肿瘤细胞膜电穿孔，使细胞膜的通透性增强，从而促进药物进入细胞内部，提高药物对细胞的毒性，进而提高对肿瘤的治疗效果。由于细胞电穿孔取决于施加的脉冲场强、脉冲时间、细胞大小、细胞种类以及悬浮液或周围组织的条件，因此，对不同的细胞进行电穿孔以及对不同的肿瘤组织进行电化学疗法的最佳条件常常通过实验来确定。目前，对电穿孔和电化学疗法的作用机理尚不十分清楚，对电化学疗法中电场在肿瘤组织中的分布以及电场分布与疗效之间的关系也不十分清楚。本文的主要研究内容如下：（1）通过实验对比研究了长时间低幅度（20V／cm）周期性瞬态电脉冲和短时间高幅度（kV／cm）电脉冲对多种离体细胞的影响。证明这两类电脉冲对细胞都有电穿孔效应，并且穿孔率和孔洞的大小除了与脉冲参数有关外，还与细胞的种类、结构、组成、形状以及细胞的活性等有关。实验发现：低幅度电脉冲对细胞膜的电穿孔是可逆的，在照射时间20～60min内，穿孔率与照射时间无明显相关性，电致孔洞在细胞膜上不断地出现，又不断地自行修复，细胞不会死亡。高幅度电脉冲对细胞电穿孔的几率随着脉冲幅度、宽度、个数的增加而增大，在单个细胞上出现电穿孔的数量多，在一定范围内，穿孔率与脉冲幅度和脉冲作用时间的乘积成正比，该乘积过大则可能造成细胞的不可逆电击穿，使细胞死亡。（2）通过选取不同的离体肿瘤细胞、抗癌药物、药物剂量、电脉冲参数以及处理方式，实验研究了脉冲联合抗癌药物对肿瘤细胞的毒性。证明电化学疗法可以明显提高药物对肿瘤细胞的毒性，尤其是电脉冲联合低剂量药物可以使细胞毒性提高3倍以上。并且，不同的肿瘤细胞对不同的抗癌药物的敏感性不同，因此，在电化学疗法中应根据肿瘤的种类选择适当的药物。（3）建立了荷S180肉瘤KM小鼠模型，通过电脉冲分别联合低剂量环磷酰胺、盐酸阿霉素以及博莱霉素治疗S180肉瘤小鼠。实验结果表明：电化学疗法组的抑瘤率达66～95％，肿瘤缩小比例为100％，完全消失的比例为41～73％，效果明显优于其它组。通过对肿瘤组织染色和切片组化分析，发现电化学疗法对肿瘤细胞的抑制作用最强，绝大部分肿瘤细胞受损甚至坏死，表明电脉冲联合化疗药物治疗荷S180肉瘤小鼠具有协同增效的作用。（4）通过电脉冲联合低剂量顺铂治疗异种移植人卵巢癌SKOV₃裸鼠，取得了很好的疗效，为电化学疗法在卵巢癌的临床应用打下了基础。上述肿瘤电化学疗法的实验表明：高幅度电脉冲对肿瘤具有较强的抑制作用，其对肿瘤的治疗作用具有选择性，这种选择性与肿瘤组织的特性以及肿瘤细胞的生物学特性有关。因此，在肿瘤电化学疗法中应根据肿瘤的特性选择合适的脉冲参数。实验中采用的药物剂量远远低于常规化疗剂量，并且在肿瘤部位直接给药，减少了药物总量以及药物的全身循环，毒副作用很小。通过对化疗后的裸鼠肾脏做病理检察表明：低剂量药物未造成裸鼠肾功能的损伤。高幅度电脉冲对肿瘤血管的生长具有明显抑制作用。经电场处理的肿瘤表面几乎无血管分布，而未经电场处理的肿瘤表面血管丰富。采用免疫组化法检测肿瘤病理切片中血管内皮生长因子VEGF受体KDR的表达，经电场处理的肿瘤的VEGF受体KDR明显下降，肿瘤血管的生长受到明显的抑制。说明高幅度电场抑制了肿瘤血管的生长，减少或完全切断了肿瘤的营养供应，促使肿瘤细胞凋亡或坏死，达到了治疗肿瘤的目的。（5）基于肿瘤组织中的电场分布在肿瘤电化学疗法中的重要性。本文针对实验中的小鼠移植肿瘤模型和实验条件，研制了用于肿瘤电化学疗法的阵列电极，对不同的阵列电极和不同的加载方法，分析了电极周围的场分布，建立了简化的肿瘤组织模型。结合肿瘤及周边组织的电参数，分析了阵列电极在肿瘤组织中产生的电场，对已有的实验结果进行了分析，并给出了电化学疗法中阵列电极的选取原则。（6）根据细胞的电介质特性，分析了外加电场与细胞形状的关系。通过分析表明：电场作用于单凸单凹形的细胞时，在细胞凹凸部位具有场的集中效应。从电场增强的角度解释了具有凹凸形状的兔血红细胞电穿孔都发生在中心处的原因。（7）采用细胞动力学模型对电穿孔的机理进行了初步探讨，从理论上分析了影响电穿孔的一些主要因素。最后就电穿孔与电场强度以及温度的关系，对酵母细胞进行了电穿孔实验研究。分别改变脉冲电压和环境温度，研究了酵母细胞的电穿孔情况。结果表明：影响电穿孔的主要因素是施加的脉冲幅度，而环境温度变化对电穿孔的影响很小，对电穿孔和电化学疗法的深入研究具有一定的参考价值。本文的创新点：（1）首次从细胞形状对电场分布的影响的角度，分析了电穿孔与细胞形状的关系。（2）首次分析了不同的阵列电极结构和不同的脉冲加载方式在肿瘤中的电场分布。（3）建立了异种移植人卵巢癌SKOV₃裸鼠模型，首次采用电化学疗法进行治疗。（4）对低幅度和高幅度电脉冲对细胞电穿孔进行了对比研究。（5）实验研究了脉冲幅度和环境温度对细胞电穿孔的影响，指出了引起细胞电穿孔的主要原因。

全文目录

摘要  4-8
Abstract  8-18
第一章概述  18-30
  1.1 引言  18
  1.2 本文的研究背景及意义  18-21
    1.2.1 研究背景  18-19
    1.2.2 研究意义  19-21
  1.3 国内外研究动态  21-27
    1.3.1 电穿孔的形成条件  21-23
    1.3.2 电穿孔的形成过程  23-24
    1.3.3 电穿孔的机理  24
    1.3.4 电穿孔的应用  24-27
  1.4 本论文的构思  27-28
    1.4.1 实验研究脉冲参数与电穿孔的关系  27-28
    1.4.2 开展肿瘤电化学疗法的实验研究  28
    1.4.3 分析电化学疗法中肿瘤组织内的电场分布  28
    1.4.4 对电穿孔的机理进行初步分析  28
  1.5 本文的主要内容  28-29
  1.6 本文的创新点  29-30
第二章低幅度和高幅度电脉冲对细胞电穿孔的实验研究  30-45
  2.1 低幅度电脉冲对细胞电穿孔的实验研究  30-36
    2.1.1 实验材料  30-31
      2.1.1.1 离体细胞  30
      2.1.1.2 主要试剂  30-31
    2.1.2 实验系统  31
    2.1.3 实验方法  31-32
      2.1.3.1 样品的制备  31-32
      2.1.3.2 台盼蓝染色实验  32
      2.1.3.3 扫描电镜样品制作  32
    2.1.4 实验结果  32-34
      2.1.4.1 台盼蓝染色情况  32-34
      2.1.4.2 扫描电镜观察  34
    2.1.5 讨论  34-36
  2.2 高幅度电脉冲对细胞电穿孔的实验研究  36-43
    2.2.1 实验材料  36-37
      2.2.1.1 离体细胞  36
      2.2.1.2 主要试剂  36-37
    2.2.2 实验系统  37
    2.2.3 实验方法  37-39
      2.2.3.1 样品的制备  38
      2.2.3.2 鸡血细胞电穿孔观察  38-39
      2.2.3.3 Hela细胞电穿孔观察  39
    2.2.4 实验结果  39-43
      2.2.4.1 鸡血细胞电穿孔的结果  39-40
      2.2.4.2 脉冲参数对Hela细胞电穿孔的影响  40-42
      2.2.4.3 Hela细胞扫描电镜观察结果  42-43
    2.2.5 讨论  43
  2.3 本章小结  43-45
第三章电脉冲结合化疗药物对肿瘤细胞株的毒性实验研究  45-57
  3.1 实验材料  46-47
    3.1.1 细胞株  46-47
    3.1.2 抗癌药物  47
  3.2 实验系统  47
  3.3 实验方法  47-50
    3.3.1 药物选择性实验  47-48
    3.3.2 MTT法检测肿瘤细胞毒性  48-49
    3.3.3 药物浓度与细胞存活率的关系  49
    3.3.4 不同处理方式对细胞生长的影响  49-50
  3.4 实验结果与分析  50-56
    3.4.1 药物选择性实验结果与分析  50-51
    3.4.2 MTT法检测结果  51-52
    3.4.3 药物浓度对细胞存活率的影响  52
    3.4.4 细胞生长的观察结果  52-56
  3.5 本章小结  56-57
第四章电化学疗法对异种移植S180肉瘤小鼠的实验研究  57-75
  4.1 电脉冲结合化疗药物治疗肿瘤的系统组成及方法  57-58
    4.1.1 治疗系统的组成  57
    4.1.2 阵列电极结构  57-58
    4.1.3 治疗方法  58
  4.2 电脉冲结合环磷酰胺的实验研究  58-68
    4.2.1 动物肿瘤模型的建立  58-59
    4.2.2 药物剂量及脉冲参数  59
    4.2.3 治疗方案  59
    4.2.4 检测方法  59-60
    4.2.5 实验结果  60-66
      4.2.5.1 肿瘤外观变化情况  60-61
      4.2.5.2 肿瘤生长统计结果  61-62
      4.2.5.3 肿瘤病理检查结果  62-66
      4.2.5.4 透射电镜观察结果  66
    4.2.6 讨论  66-68
  4.3 电脉冲结合盐酸阿霉素的实验研究  68-69
    4.3.1 动物肿瘤模型的建立  68
    4.3.2 药物剂量及脉冲参数  68
    4.3.3 治疗方案和检测方法  68
    4.3.4 实验结果  68-69
    4.3.5 讨论  69
  4.4 电脉冲结合博莱霉素的实验研究  69-73
    4.4.1 动物肿瘤模型的建立  69-70
    4.4.2 药物剂量及脉冲参数  70
    4.4.3 治疗方案和检测方法  70
    4.4.4 实验结果  70-73
      4.4.4.1 肿瘤外观变化情况  70
      4.4.4.2 肿瘤生长统计结果  70-73
    4.4.5 讨论  73
  4.5 本章小结  73-75
第五章电化学疗法对异种移植人卵巢癌SKOV_3裸鼠的实验研究  75-87
  5.1 动物肿瘤模型的建立  75-76
  5.2 药物剂量及脉冲参数  76
  5.3 治疗方案  76
  5.4 检测方法  76
  5.5 实验结果  76-83
    5.5.1 肿瘤生长统计结果  76-80
    5.5.2 血清CA_(125)检测结果  80
    5.5.3 组织病理切片HE染色检测结果  80-82
    5.5.4 血管内皮生长因子VEGF检测结果  82
    5.5.5 肿瘤细胞凋亡检测结果  82-83
  5.6 本章小结  83-87
第六章阵列电极在肿瘤中激励的电场分析  87-100
  6.1 脉冲波形及频谱分析  87-88
  6.2 阵列电极在均匀无耗介质中激励的电场  88-93
    6.2.1 计算方法  88-90
    6.2.2 对称的阵列电极的电场分布  90-92
    6.2.3 七针阵列电极的电场分布  92-93
    6.2.4 脉冲加载方式对电场分布的影响  93
    6.2.5 结论  93
  6.3 肿瘤组织内电场分布的计算模型  93-95
    6.3.1 肿瘤及周边组织的介电性能  94
    6.3.2 肿瘤计算模型  94-95
  6.4 对称的阵列电极在肿瘤中产生的电场  95-98
    6.4.1 阵列电极半径小于肿瘤半径  95
    6.4.2 阵列电极半径大于肿瘤半径  95
    6.4.3 讨论  95-98
  6.5 交替加载和七针阵列电极在肿瘤中产生的电场  98
  6.6 本章小结  98-100
第七章细胞电穿孔机理分析  100-113
  7.1 细胞的电学特性  101-102
    7.1.1 细胞静息膜电位  101
    7.1.2 细胞膜电容  101-102
    7.1.3 细胞膜电阻  102
  7.2 简化细胞模型  102-103
  7.3 细胞的跨膜电位  103-105
    7.3.1 对细胞跨膜电位的描述  103-104
    7.3.2 用细胞跨膜电位解释电穿孔形成的原因  104-105
  7.4 细胞形状与膜内电场分布的关系  105-107
    7.4.1 球形细胞  105
    7.4.2 凹凸形细胞  105-107
  7.5 电穿孔的力学模型及分析  107-109
  7.6 环境温度对细胞电穿孔的影响  109-111
    7.6.1 实验材料  109
    7.6.2 实验方法  109-110
    7.6.3 实验结果  110-111
    7.6.4 讨论  111
  7.7 本章小结  111-113
第八章总结与展望  113-118
  8.1 总结  113-116
  8.2 创新点  116-117
  8.3 展望  117-118
攻读博士学位期间发表的论文  118-120
攻读博士学位期间的科研工作情况  120
攻读博士学位期间的获奖情况  120-121
致谢  121-123
参考文献  123-135
符号说明  135-138

细胞电穿孔机理分析及电穿孔在肿瘤治疗中的应用

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