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电穿孔介导的kallistatin基因表达及对小鼠IBD模型的预防治疗作用
作 者: 熊真珍
导 师: 刁勇
学 校: 华侨大学
专 业: 高分子化学与物理
关键词: IBD Kallistatin 电穿孔 基因治疗
分类号: S858.91
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要
炎症性肠病(IBD)是一种天然免疫性疾病。目前其发病机理尚不明确,临床上尚无有效的治疗药物。Kallistatin(Kal)是一种血管生成抑制剂和肝素结合蛋白,其在生理和病理反应中有多种作用,如抗炎、抗血管生成等,被认为是肠炎、关节炎、损伤修复的候选药物。本实验首先通过对两种质粒的酶切鉴定,X-gal染色法和细胞免疫荧光法验证了pAAV-LacZ质粒和pAAV-Kal质粒,及对细胞转染鉴定了Kal可在细胞内表达。并利用电穿孔法将基因导入昆明小鼠体内,比较其与非电穿孔法介导的基因表达差异。同时检测电穿孔介导的Kal在不同转染浓度、不同时间的表达情况,并绘制不同转染浓度下的表达曲线。使用电穿孔法介导Kal对三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的小鼠IBD模型进行基因预防治疗,通过检测小鼠的体重变化、存活率、以及病理切片分析Kal对其治疗效果。并通过组织免疫荧光法初步探讨Kal在小鼠结肠炎中的抗炎机制。研究结果显示电穿孔介导Kal基因表达可以剂量依赖性的降低IBD模型的炎症反应。结肠病理切片分析显示,Kal可以降低单核细胞的侵袭,同时利用免疫荧光发现Kal多集中于炎症区,我们推测这可能说明Kal可靶向单核细胞或肠上皮细胞。因此,我们认为电穿孔法是一种有效的基因传递方法,Kal可以作为治疗IBD的基因药物。
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全文目录
摘要 4-5 Abstract 5-9 第一章 引言 9-27 1.1 Kallistatin 的研究进展 9-17 1.1.1 Kallistatin 的特性及结构活性关系 9-10 1.1.2 Kallistatin 的分布及调节 10-11 1.1.3 Kallistatin 的功能 11-16 1.1.4 总结及展望 16-17 1.2 炎症性肠病机制研究进展 17-22 1.2.1 肠道微生物的“两面性” 17-18 1.2.2 保持肠道内平衡路径的研究 18-19 1.2.3 炎性体研究(Inflammsome) 19-20 1.2.4 NOD2 的研究 20-21 1.2.5 天然免疫、结肠炎和组织修复 21-22 1.3 活体电穿孔的研究进展 22-27 1.3.1 活体电穿孔的的原理和特点 22-23 1.3.2 影响活体电穿孔效率的因素 23-24 1.3.3 活体电穿孔在不同组织上的应用 24-25 1.3.4 活体电穿孔与核酸免疫 25 1.3.5 活体电穿孔与基因治疗 25-26 1.3.6 展望 26-27 第二章 pAAV-Kal 及pAAV-LacZ质粒的细胞内表达 27-36 2.1 实验材料、试剂与仪器 27-28 2.1.1 实验材料 27 2.1.2 实验试剂 27 2.1.3 主要实验仪器 27-28 2.2 实验方法 28-34 2.2.1 主要试剂配制 28-29 2.2.2 pAAV-Kal 及pAAV-LacZ 质粒的转化及鉴定 29-31 2.2.3 质粒的大量提取、纯化及浓度测定 31-32 2.2.4 细胞培养 32-33 2.2.5 质粒表达鉴定 33-34 2.3 实验结果与分析 34-36 2.3.1 pAAV-LacZ 及pAAV-Kal 酶切鉴定 34 2.3.2 pAAV-LacZ 及pAAV-Kal 在细胞内表达 34-35 2.3.3 小结 35-36 第三章 电穿孔介导pAAV-Kal 及pAAV-LacZ质粒在小鼠体内的表达 36-50 3.1 实验材料、试剂与仪器 36-37 3.1.1 实验材料 36 3.1.2 实验试剂 36 3.1.3 主要实验仪器 36-37 3.2 实验方法 37-44 3.2.1 主要试剂配制 37 3.2.2 活体电穿孔法介导LacZ 质粒在小鼠体内的表达 37-41 3.2.3 活体电穿孔法转导pAAV-Kal 质粒在小鼠体内的表达 41-44 3.2.4 实验数据分析 44 3.3 实验结果及分析 44-49 3.3.1 活体电穿孔法介导LacZ 质粒在小鼠体内的表达 44-46 3.3.2 活体电穿孔法介导pAAV-Kal 质粒在小鼠体内的表达 46-49 3.4 讨论 49-50 第四章 Kal 对小鼠结肠炎的预防治疗作用 50-56 4.1 实验材料、试剂与仪器 50 4.1.1 实验材料及仪器 50 4.1.2 实验试剂 50 4.2 实验方法 50-52 4.2.1 主要试剂配制 50 4.2.2 动物模型建立及给药 50-51 4.2.3 Kal 对肠炎小鼠预防作用 51 4.2.4 数据分析 51-52 4.3 实验结果与分析 52-55 4.3.1 小鼠体重变化及死亡率 52-53 4.3.2 模型小鼠结肠长度变化 53 4.3.3 小鼠结肠组织病理切片及免疫荧光分析 53-55 4.4 讨论 55-56 结论 56-57 论文创新点 57 发表论文及参加会议情况 57-58 参考文献 58-69 致谢 69
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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学(兽医学) > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 野生动物疾病 > 实验用动物
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