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SARS病原体原位检测及发病机制研究

作　者: 贺莉
导　师: 丁彦青
学　校: 第一军医大学
专　业: 病理学
关键词: SARS-CoV ACE2 细胞因子免疫组织化学原位杂交
分类号: R511.9
类　型: 博士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

研究背景严重急性呼吸综合征(Severe acute respiratory syndrome，mARS)是一种以呼吸道症状为主的急性传染病，其主要病变以急性肺损伤(acute lunginjury，ALI)为主，可合并全身多脏器损害，病死率较高，引起国际社会广泛关注和医学界的高度重视。在各国医学专家的共同努力下，2003年4月16日世界卫生组织(WHO)正式宣布，mARS是由一种新型冠状病毒引起，并命名为SARm冠状病毒(SARm coronavirus，SARS-CoV)。根据WHO统计，2002～2003年SARS流行期间，全球共有8400名确诊病例，约900余名患者死亡，由于该病传染性强，发病率及死亡率高，被誉为21世纪初世界范围内发生的重大事件之一。广东省曾是我国SARS发病最早，发病率最高，影响最大的省份，为弄清SARS病因及发病机制，我们在当时对本病认识不清，无特殊防护条件下，开展了国际首例和较早的3例尸检，虽然目前在病原学及流行病学等方面取得重大进展，但其发病机制尚不完全清楚，因此我们利用4例尸检资料，对mARS-CoV在全身组织和器官的分布及发病机制进行探讨，希望对mARS及其它呼吸道病毒疾病的预防和治疗提供有用信息。目的1．对病变组织内病毒包涵体、病毒颗粒以及SARS-CoV N基因及S基因进行原位检测，观察SARS-CoV在全身组织和器官的分布、探讨SARS-CoV传播途径及致病机制；2．通过观察SARS尸检组织中血管紧张素转换酶2(angiotensin-convertingenzyme 2，ACE2)与SARS-CoV S蛋白的分布，探讨ACE2和SARS-CoY S蛋白在SARS尸检组织中的表达及其相互作用关系；3．通过检测免疫细胞标志物及细胞因子(CD3、CD4、CD8、CDl6、CD20、CD25、CD45RO、CD68、Ki67、Mac387、IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1、MCP-1)在SARS病变组织中的表达，分析它们在SARS发病中的作用；4．通过检测SARS病变组织的细胞凋亡情况，阐述细胞凋亡在SARS发病中的作用机制。材料和方法收集2003年3月至5月期间第一军医大学南方医院病理科4例SARS完整尸体解剖资料，分别取肺、气管、心脏、肝、肾、肾上腺、脾、食道、胃、小肠、胰腺、脑、垂体、甲状腺、甲状旁腺、淋巴结、皮肤、子宫、卵巢以及睾丸等组织，4例尸检病例均符合WHO SARS临床诊断标准，以心源性猝死患者相应组织作为对照。全部标本用4％中性甲醛固定，石蜡包埋，4μm切片。采用组织病理学、组织化学、免疫组织化学、免疫组织化学双染法、免疫组织化学与组织化学双染法、原位杂交技术及透射电镜等方法对4例SARS尸检组织中病毒包涵体、病毒颗粒、SARS-CoV N基因、SARS-CoV S基因、免疫细胞标志物(CD3、CD4、CD8、CDl6、CD20、CD25、CD45RO、CD68、Ki67、Mac387)、细胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1、MCP-1)、功能性受体ACE2以及凋亡细胞(Klenow-FragEL DNA Fragmentation、Fas／FasL)进行检测。结果1．肺组织病原体原位检测结果：1．1组织病理学观察：4例尸检肺组织部分增生脱落的肺泡上皮细胞及渗出的单核巨噬细胞内可见病毒包涵体，包涵体多呈球形，约红细胞大小，嗜酸性染色，周围可见透明晕。1．2组织化学观察：对4例SARS肺组织用Macciavello法(病毒包涵体染色)进行检测，3例肺组织肺泡上皮及局部浸润单核细胞内发现典型的病毒包涵体，包涵体红细胞大小呈紫红色。1．3透射电镜观察：肺泡上皮明显肿胀，内浆网扩张，线粒体及内浆网明显空泡变性。Ⅰ型和Ⅱ型上皮细胞增生，尤以Ⅱ型上皮增生明显。增生的Ⅱ上皮细胞胞浆板层小体明显减少或缺如，粗面内浆网(PER)及滑面内浆网(SER)均大量增生、扩张，扩张SER池内有电子密度增高的蛋白分泌物，部分扩张的SER内可见群集的、大小较一致的病毒颗粒，表面有细小的花冠状微粒，颗粒大小约60-90nm。部分胞核内见有膜性层状包涵体。间质血管内皮细胞肿胀、空泡变性。肺泡腔内有少量渗出的单核细胞、淋巴细胞和浆细胞。1．4免疫组化观察：SARS-CoV N蛋白及S蛋白特异性单克隆抗体检测发现肺泡上皮细胞、单核巨噬细胞、支气管纤毛柱状上皮细胞及浆液腺腺上皮细胞均呈阳性表达，正常对照肺组织SARS-CoV N蛋白及S蛋白标记阴性。1．5原位分子杂交观察：SARS-CoV N及S基因mRNA水平检测发现肺泡上皮细胞、单核巨噬细胞、支气管纤毛柱状上皮细胞及浆液腺腺上皮细胞均可见阳性杂交信号；正常对照肺组织SARS-CoV N及S基因mRNA杂交信号阴性。2．肺外组织病原体原位检测结果：对4例SARS尸检组织N基因及S基因从蛋白和mRNA水平检测发现食道鳞状上皮、胃壁细胞、小肠黏膜柱状上皮细胞、心肌纤维、肾远曲小管上皮细胞、皮肤汗腺上皮细胞、肾上腺皮质细胞、甲状旁腺嗜酸性细胞、胰腺胰岛细胞、大脑神经元、垂体嗜酸性细胞、肝细胞及睾丸曲细精管等均呈阳性表达；而在SARS脾及淋巴结淋巴细胞、甲状腺、卵巢、子宫等细胞或组织未检测到SARS-CoV N基因及S基因；对照组SARS-CoV N基因及S基因蛋白和mRNA均呈阴性。3．功能性受体ACE2基因与SARS-CoV S基因检测结果比较对4例SARS尸检组织ACE2及S基因从蛋白和mRNA水平检测支气管、肺、心肌、肝、肾、肾上腺、胃、小肠、胰腺、脑、甲状腺、甲状旁腺、皮肤、睾丸、卵巢及子宫等组织发现肺组织增生和脱落的上皮细胞及浸润的单核／巨噬细胞、气管及支气管上皮细胞及浆液腺腺上皮细胞、小肠黏膜柱状上皮细胞、心肌纤维、胃壁细胞、肾远曲小管上皮细胞、食道粘膜鳞状上皮、皮肤汗腺上皮细胞、肾上腺皮质细胞、甲状旁腺嗜酸性细胞、胰腺胰岛细胞、大脑神经元、垂体嗜酸性细胞、肝细胞及睾丸曲细精管等蛋白和mRNA检测均呈阳性；脾脏及淋巴结淋巴细胞、甲状腺、卵巢及子宫无阳性表达。蛋白表达阳性部位定位于细胞质，呈棕黄色；杂交信号定位于细胞质，呈蓝黑色；对照组相应组织ACE2基因蛋白和mRNA水平检测与SARS尸检组织检测结果一致，SARS-CoV S基因蛋白和mRNA水平检测均呈阴性。4．病理变化观察及免疫细胞标志物检测结果肺：病变肺组织呈脱屑性肺泡炎及脱屑性支气管炎改变，肺泡腔内充满大量脱落和增生的肺泡上皮细胞，增生脱落的肺泡上皮细胞体积明显增大，部分细胞相互融合呈合体细胞状，肺泡腔内可见透明膜形成，肺组织局灶性坏死，坏死处可见中性粒细胞、单核巨噬细胞及少量淋巴细胞浸润；淋巴结：淋巴滤泡消失，淋巴细胞呈点片状坏死，淋巴窦内可见大量单核巨噬细胞增生，部分单核巨噬细胞呈活化状态，经Ki67及CD45RO双染标记的T淋巴细胞呈散在阳性，CD4~+、CD8~+T．淋巴细胞，自然杀伤细胞(NK细胞)明显减少；脾：脾小体高度萎缩，红髓淋巴组织大片状坏死，坏死灶内可见成片的单核巨噬细胞浸润；心脏：心肌间质水肿，间质内小血管内皮细胞肿胀，血管壁水肿，可见单核和淋巴细胞浸润；肝脏：肝细胞索明显解离，肝细胞脂肪变性及小灶性坏死，可见单核巨噬细胞浸润；肾脏及肾上腺组织可见小灶性坏死，肾间质小动脉、小静脉呈血管炎的表现，局部主要浸润细胞为单核和淋巴细胞。5．细胞因子检测结果对4例SARS尸检组织肺、支气管、食管、胃、小肠、肝、心肌、血管、肾、肾上腺、胰腺、脑组织、甲状腺、甲状旁腺、睾丸及皮肤等组织细胞因子IL-1β，IL-6，TNF-α，TGF-β1，MCP-1蛋白和mRNA水平检测发现肺组织增生和脱落的上皮细胞及浸润的单核／巨噬细胞、气管及支气管上皮细胞及浆液腺腺上皮细胞、胃壁细胞、肝细胞、心肌纤维、肾远曲小管上皮细胞、胰腺胰岛细胞、肾上腺皮质细胞、皮肤汗腺上皮细胞、脑垂体嗜酸性细胞均呈不同程度阳性表达，小肠黏膜柱状上皮细胞MCP-1和TGF-β1标记显示阳性、食管鳞状上皮、甲状旁腺、睾丸生精上皮及甲状腺滤泡上皮细胞呈阴性表达。正常对照组肾远曲小管上皮细胞TGF-β1及TNF-α呈阳性表达，余阴性。阳性部位定位于细胞质，呈棕黄色。用免疫组织化学与奥新兰双重染色发现支气管浆液腺腺上皮细胞IL-1β，IL-6，TNF-α，TGF-β1，MCP-1呈棕黄色，而黏液腺上皮细胞显示蓝色。6．细胞凋亡检测结果经Klenow-FragEL DNA Fragmentation、Fas／FasL检测发现肺组织、脾脏和淋巴结的凋亡细胞明显增多。病变肺组织的凋亡细胞主要为肺泡上皮细胞、支气管上皮细胞、单核巨噬细胞等；病变淋巴结和脾脏内可见大量淋巴细胞和单核巨噬细胞存在凋亡现象。结论1．SARS是一种全身多器官损伤性疾病，肺是SARS病毒主要攻击的靶器官，急性肺损伤是本病死亡的主要原因；2．首次提出SARS除呼吸道和消化道传播外，还可能通过尿液和皮肤接触传播的新观点；3．功能性受体ACE2与SARS-CoV S基因在多种细胞内表达和定位一致，首次在SARS尸检组织中确认ACE2为SARS-CoV的功能性受体；4．前炎症细胞因子(IL-1β，IL-6，TNF-α，TGF-β1，MCP-1)与SARS-CoV S蛋白及受体ACE2在组织和细胞内表达一致，提示SARS-CoV感染的细胞可能过度分泌PlCs(proinflammatory cytokines，Pies)，引起免疫介导的肺和其它器官损害，导致ALI和全身多器官机能障碍；5．细胞凋亡可能在ALI发生中起重要作用。

全文目录

摘要  3-8
ABSTRACT  8-16
前言  16-24
第一部分 SARS病原体原位检测  24-47
  1.1 组织病理学及组织化学观察  24-25
  1.2 超微结构观察  25-26
  1.3 SARS-CoV N基因检测  26-29
  1.4 SARS-CoV S基因检测  29-37
  参考文献  37-39
  附图  39-47
第二部分 SARS发病机制研究  47-93
  2.1 SARS功能性受体ACE2在SARS尸检组织中的表达  47-54
  2.2 SARS病理观察、免疫细胞标志物及细胞因子检测  54-64
  2.3 细胞凋亡在SARS病变组织中的作用  64-68
  参考文献  68-72
  附图  72-93
全文小结  93-95
综述  95-109
撰写论文情况  109-110
英文缩写词中英文对照表  110-111
致谢  111-113

SARS病原体原位检测及发病机制研究

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