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细菌的Sir2蛋白研究

作　者: 谷晶
导　师: 张先恩；邓教宇
学　校: 中国科学院研究生院（武汉病毒研究所）
专　业: 微生物学
关键词: 去乙酰化酶结核分枝杆菌 CobB Sir2 NAD~+
分类号: Q93
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

依赖于NAD~+的去乙酰化酶 Sir2是一种重要的调控酶类，参与染色质沉默，DNA损伤修复，细胞凋亡，新陈代谢和衰老等细胞生命过程。Sir2蛋白是一类十分保守的蛋白。目前对Sir2蛋白家族的绝大部分研究和成果都集中于真核生物，而对原核生物的Sir2蛋白只有零星报道。本实验研究了异源表达的大肠杆菌(E. coli K12)Sir2同源蛋白CobB以及病原菌结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis H37Rv)的Sir2蛋白。对两种同源蛋白质的表达，纯化，酶活性，最适作用条件，抑制物作用等进行多样化实验。同时进行大肠杆菌cobB基因缺失菌株的参比实验来研究其对抗逆性和耐药性的影响。分别从E. coli K12和Mycobacterium tuberculosis H37Rv基因组DNA中克隆目的基因插入到pET32a表达载体，在大肠杆菌AD494中表达重组蛋白。随后对CobB蛋白进行包括依赖于NAD~+的去乙酰化和ADP—核糖转移活性的测定和性质研究，得到该酶的最适反应温度是25℃，最适反应pH值是9.0±1.0。在偏酸性环境中，抑制物烟酰胺(NAM)，烟酸(NA)，吡嗪酸(POA)和2—羟基—1—萘甲醛(2-Hydroxy-1-naphthaldehyde，HN)对酶活有抑制，而在偏碱性环境中，只有烟酰胺和HN有抑制作用。在体内实验中，发现cobB基因缺失突变株对于热激，酸激的耐受力远远低于野生型菌株，而对吡嗪酰胺，烟酰胺和饥饿的耐受力要高于野生型菌株，并观察到当CobB超量表达时，大肠杆菌的菌体形态发生显著变化。对异源表达的结核分枝杆菌Mycobacterium tuberculosis H37Rv的Sir2蛋白体外实验表明，其最适温度和最适pH值与重组的CobB蛋白相同，但ADP—核糖转移活性的比大肠杆菌CobB强，抑制物的抑制作用类似。研究结果为进一步了解Sir2蛋白在细菌中的作用提供了一定的基础，并为研究抗结核药物PZA的抑菌机制提供了新的线索。

全文目录

摘要  2-3
Abstract  3-11
第一章引言  11-27
  1.1 Sir2蛋白的分类及分布  12
  1.2 Sir2的作用机制  12-16
  1.3 Sir2的功能  16-20
    1.3.1 染色质沉默  16-18
    1.3.2 长寿与衰老  18-19
    1.3.3 Sir2在DNA损伤修复中的作用  19
    1.3.4 Sir2在细胞代谢中的作用  19-20
      1.3.4.1 真核细胞中的作用  19-20
      1.3.4.2 原核生物中Sir2蛋白的功能  20
  1.4.Sir2的影响因子  20-22
    1.4.1 抑制因子  20-21
    1.4.2 激活因子  21-22
  1.5 Sir2的蛋白质结构  22-23
  1.6 Sir2在NAD的代谢途径中的作用  23-25
  1.7 研究Sir2蛋白的意义  25-26
    1.7.1 研究原核生物中Sir2蛋白的生物学意  25
    1.7.2 研究Sir2蛋白对结核病治疗的意义  25-26
  1.8 本课题的研究目的与计划  26-27
第二章大肠杆菌CobB的研究  27-53
  2.1 前言  27
  2.2 材料与方法  27-37
    2.2.1 试验材料  27-31
      2.2.1.1 菌株与质粒  27-28
      2.2.1.2 培养基  28-29
      2.2.1.3 试剂  29
      2.2.1.4 溶液及缓冲液  29-31
      2.2.1.5 实验仪器  31
    2.2.2 实验方法  31-37
      2.2.2.1 大肠杆菌K12基因组的提取  31
      2.2.2.2 大肠杆菌质粒的提取  31
      2.2.2.3 利用PCR扩增大肠杆菌cobB基因  31-32
      2.2.2.4 大肠杆菌cobB基因表达载体的构建  32
      2.2.2.5 大肠杆菌的转化  32-33
        Ⅰ、感受态细胞的制备(CaCl2法)  32-33
        Ⅱ、大肠杆菌的转化  33
      2.2.2.6 重组质粒的筛选、验证  33
      2.2.2.7 重组CobB蛋白的诱导表达  33
      2.2.2.8 重组CobB蛋白的大量表达与纯化  33-34
      2.2.2.9 SDS-PAGE分析蛋白纯度及分子量  34-35
      2.2.2.10 蛋白质的浓度测定  35
      2.2.2.11 CobB活性的测定  35-36
        Ⅰ、依赖于NAD~+的去乙酰化酶活性  35
        Ⅱ、ADP—核糖转移酶活性  35-36
        Ⅲ、抑制物试验  36
      2.2.2.12 cobB缺失突变菌株W3110试验  36-37
        Ⅰ、酸激试验  36
        Ⅱ、热激试验  36
        Ⅲ、吡嗪酰胺和烟酰胺耐受试验  36
        Ⅳ、饥饿耐受试验  36-37
      2.2.2.13 CobB超量表达试验  37
  2.3 结果与分析  37-50
    2.3.1 大肠杆菌cobB从基因组的克隆  37
    2.3.2 大肠杆菌cobB表达载体的构建与验证  37-39
    2.3.3 大肠杆菌CobB蛋白的表达与纯化  39-40
    2.3.4 大肠杆菌CobB的活性鉴定  40-44
      2.3.4.1 去乙酰化酶活性测定  40
      2.3.4.2 最适合反应温度和pH值  40-41
      2.3.4.3 抑制物对酶活的影响  41-43
      2.3.4.4 ADP—核糖转移酶活性  43-44
    2.3.5 cobB缺失突变菌株W3110试验  44-47
      2.3.5.1 热激试验  44-45
      2.3.5.2 酸激试验  45-46
      2.3.5.3 吡嗪酰胺和烟酰胺耐受试验  46-47
      2.3.5.4 饥饿耐受试验  47
    2.3.6 CobB的超量表达对菌体形态的影响  47-50
  3.4 讨论  50-53
第三章结核分枝杆菌Sir2的体外酶活性研究  53-64
  3.1 前言  53-54
  3.2 材料与方法  54-56
    3.2.1 试验材料  54-56
      3.2.2.1 结核分枝杆菌基因组的提取  54-55
      3.2.2.2 大肠杆菌质粒的提取  55
      3.2.2.3 PCR扩增结核分枝杆菌sir2基因  55
      3.2.2.4 结核分枝杆菌sir2基因表达载体的构建  55-56
      3.2.2.5 大肠杆菌的转化  56
      3.2.2.6 重组质粒的筛选、验证  56
      3.2.2.7 蛋白质的诱导生成  56
      3.2.2.8 蛋白质的大量表达与纯化  56
      3.2.2.9 SDS-PAGE分析蛋白纯度及分子量  56
      3.2.2.10 蛋白质的浓度测定  56
      3.2.2.11 Sir2活性的测定  56
        Ⅰ、依赖于NAD~+的去乙酰化酶活性  56
        Ⅱ、ADP—核糖转移酶活性  56
        Ⅲ、抑制物试验  56
  3.3 结果与分析  56-63
    3.3.1 从基因组克隆结核分枝杆菌sir2基因  56-57
    3.3.2 结核分枝杆菌sir2表达载体的构建与验证  57-58
    3.3.3 结核分枝杆菌Sir2蛋白的表达与纯化  58-59
    3.3.4 结核分枝杆菌Sir2的活性鉴定  59-63
      3.3.4.1 依赖于NAD~+的去乙酰化酶活性  59
      3.3.4.2 最适反应温度和pH值  59-60
      3.3.4.3 抑制物对酶活的影响  60-62
      3.3.4.4 ADP—核糖转移酶活性  62-63
  3.4 讨论  63-64
第四章结论  64-65
参考文献  65-74
发表文章目录  74-75
致谢  75

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中图分类: > 生物科学 > 微生物学
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