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Cyt b-559α链Arg～（18）和Ser～（24）的定点突变及其对PSII功能的影响

作　者: 马晶晶
导　师: 匡廷云；李良璧；荆玉祥
学　校: 中国科学院研究生院（植物研究所）
专　业: 植物学
关键词: Cyt b-559 定点突变 PSII 叶绿体转化衣藻
分类号: Q945.11
类　型: 博士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

Cyt b-559是光系统II反应中心的成分之一,它由α亚基和β亚基组成的。在Cyt b-559中,血红素辅基与两个亚基中的组氨酸连接成有功能的蛋白,并维持PSII的功能稳定性。前人曾将与血红素相连的His突变,导致Cyt b-559功能和PSII稳定性的丧失。基于此研究,本文采用定点突变技术,将α亚基中与His23位置最近的上游氨基酸Arg18分别用Gly和Glu取代,下游氨基酸Ser24用Phe取代,获得了衣藻Cyt b-559的突变体。对突变体的分析,有以下新结果:突变体都能进行光合自养,但无论在异养培养基上还是自养培养基上,和对照相比,其生长速度非常缓慢; PSII的活性分析,表明PSII的放氧活性为野生衣藻细胞的50%～80%, Fv/Fm的荧光参数为40%～70%;对突变体进行强光(1000μE·m-2·s-1)照射,10min后,其放氧活性都降低为0,而野生型衣藻还保持35%的活性;提取类囊体膜蛋白,进行SDS-PAGE电泳和Western-blotting分析,显示突变体的膜蛋白与对照无显著差异。这些结果说明对围绕血红素环境的固有氨基酸的改变,虽然并没有明显影响类囊体膜蛋白的表达和组成,但是却影响了衣藻细胞的生长和PSII的活性,增加了衣藻细胞对强光的敏感性,降低了衣藻细胞自身的光保护能力。这说明靠近血红素配位环境的氨基酸Arg和Ser,尤其是Arg,对Cyt b-559的功能维持不可缺少,对于维持PSII的活性也很重要。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-10
缩写词  10-13
第一章文献综述  13-46
  第一节 Cyt b-559 的结构与功能及其研究进展  13-27
    一、Cyt b-559 的结构与性质  13-20
      1、蛋白和基因  13-16
      2、 Cyt b-559 的其它组分  16-18
      3、物理化学特性  18-19
      4、Cyt b-559 的生物进化特征  19
      5、Cyt b-559 在PSII 反应中心内的位置  19-20
    二、Cyt b-559 的功能  20-24
      1、Cyt b-559 在PSII 电子传递中的作用  20-22
      2、Cyt b-559 在水氧化中的作用  22
      3、Cyt b-559 的FQR 功能  22-23
      4、Cyt b-559 的超氧化物歧化酶活性  23
      5、Cyt b-559在PSII组装中的作用  23-24
      6、Cyt b-559 的质体醌氧化酶的作用  24
    三、研究Cyt b-559 的热门方法  24-27
      1、EPR 谱  24
      2、共振拉曼光谱和傅立叶变换红外光谱  24-25
      3、穆斯堡尔谱  25
      4、时间分辨光谱技术  25
      5、分子生物学方法  25-27
  第二节衣藻及其叶绿体遗传转化研究  27-34
    一、衣藻的基本结构及其功能  27-29
      1. 细胞壁  27-28
      2. 细胞核和核基因组  28
      3. 叶绿体和叶绿体基因组  28-29
      4、其它结构  29
    二、衣藻的叶绿体转化研究  29-32
      1、叶绿体转化  30-31
      2、衣藻叶绿体转化  31-32
    三、衣藻的光合研究进展  32-34
  第三节定点突变技术及其在Cyt b-559 研究中的应用  34-46
    一、基于PCR的点突变  35-38
    二、PCR介导的随机突变  38-39
    三、PCR诱变法与其他诱变法的比较  39-40
    四、点突变所用寡核苷酸的设计特点  40
    五、通过突变研究蛋白质功能的原则  40-42
    六、结论  42
    七、突变技术在Cyt b-559功能研究中的应用  42-46
第二章本论文的立题依据、目的和意义及拟采取的技术路线  46-48
  一、立题依据、目的及意义  46-47
  二、拟采取的技术路线  47-48
第三章材料与方法  48-72
  第一节实验材料  48-53
    一、植物材料  48
    二、菌株和质粒  48
    三、使用的药品和常用试剂  48-53
  第二节实验方法  53-72
    一、质粒DNA 的小量提取（碱裂解法）  53
    二、质粒的大量提取  53-55
    三、酶切，连接反应  55-56
    四、DNA 的回收纯化  56-57
    五、大肠杆菌感受态的制备  57-58
    六、质粒DNA 的转化  58
    七、利用大引物突变法进行定点突变  58-61
    八、基因枪微弹轰击衣藻叶绿体转化  61-63
    九、转化后衣藻的过渡培养  63
    十、基因转化后衣藻的筛选培养  63
    十一、衣藻DNA的提取  63-64
    十二、Southern 杂交（地高辛标记法）  64-66
    十三、衣藻类囊体膜蛋白多肽组分的样品处理  66
    十四、衣藻类囊体膜蛋白多肽组分的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)  66-68
    十五、Western 杂交  68-69
    十六、衣藻突变体的生长速率的测定  69
    十七、叶绿素含量测定  69-70
      1、衣藻细胞中的叶绿素测定  69-70
      2、类囊体膜蛋白的叶绿素测定  70
    十八、吸收光谱的测定  70
    十九、放氧速率的测定  70
    二十、衣藻荧光动力学参数的测定  70-71
    二十一、强光照射的实验方法  71-72
第四章结果与分析  72-105
  第一节突变载体构建前的准备  72-77
  第二节衣藻Cytb-559α链的定点突变  77-84
    一、突变体R18G的载体构建  77-79
    二、突变体R18E 的载体构建  79-81
    三、突变体S24F的载体构建  81-84
  第三节衣藻Cyt b-559α链突变体R18G 和R18E 的筛选、分子鉴定和生理生化分析  84-92
    一、衣藻突变体R18G 和R18E 的抗生素筛选  84-85
    二、衣藻突变体R18G 和R18E 的分子鉴定  85-86
    三、衣藻突变体R18G 和R18E 类囊体膜蛋白多肽组分的SDS-PAGE、Western blotting和吸收光谱  86-88
    四、衣藻野生型和突变体R18G 和R18E 生长速度比较  88-89
    五、衣藻突变体R18G和R18E的荧光参数的测定  89
    六、衣藻突变体R18G和R18E的PSII放氧活性的测定  89-91
    七、衣藻突变体R18G 和R18E 对强光的敏感性  91-92
  第四节衣藻Cyt b-559α链突变体524F 的筛选、分子鉴定和生理生化分析  92-98
    一、衣藻突变体524F的抗生素筛选  92
    二、衣藻突变体524F的分子鉴定  92-93
    三、衣藻突变体524F 类囊体膜蛋白多肽组分的SDS-PAGE、Western blotting 和吸收光谱  93-94
    四、衣藻野生型和突变体524F生长速度的比较  94-96
    五、衣藻突变体524F 的荧光参数和PSII 放氧活性的测定  96
    六、衣藻突变体524F对强光的敏感性  96-98
  第五节讨论  98-105
    一、Cyt b-559 α链中Arg~(18) 和Ser~(24)的突变对衣藻细胞生长的影响  99
    二、Cyt b-559 α链中Arg~(18) 和Ser~(24)的突变对PSII活性的影响  99-100
    三、Cyt b-559 α链中Arg~(18) 和Ser~(24)的突变对其光保护功能的影响  100-102
    四、Cyt b-559 α链中Arg~(18) 和Ser~(24)的突变影响其功能的机理推测  102-105
第五章结论及未来工作展望  105-108
  一、结论  105-106
  二、今后工作的设想  106-108
参考文献  108-117
致谢  117-118
个人简历  118-120

Cyt b-559α链Arg～（18）和Ser～（24）的定点突变及其对PSII功能的影响

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