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SNAREs蛋白和钾离子通道蛋白参与调节大菱鲆免疫应答

作　者: 柴迎梅
导　师: 李光友；黄晓航
学　校: 中国海洋大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 大菱鲆免疫应答 SNARE蛋白钾离子通道
分类号: S943
类　型: 博士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

鳗弧菌是危害我国水产养殖业的主要病原菌.本文采用分子生物学,免疫学和膜片钳等技术,研究养殖鱼类-大菱鲆(Scophthalmus maximus),在受到病原菌感染后,SNARE蛋白和钾离子通道参与免疫应答防御机制的调控作用。通过腹腔注射半致死剂量的鳗弧菌,研究受感染的大菱鲆在感染初期所诱发的一系列应激反应。通过鉴定外周血液白细胞的吞噬和杀灭鳗弧菌的活性,以及外周血、脾脏和头肾白细胞所发生的呼吸爆发的活性,血清中细胞因子-白介素1β的含量的变化,研究抗鳗弧菌的先天性免疫应答防御机制。结果发现在感染24hr后,白细胞吞噬鳗弧菌的百分数从47.25%增加到61.18%,吞噬鳗弧菌的指数从4.68增加到5.62;杀菌活性从1.26增加到1.73;呼吸爆发活性OD600值从0.07增加到0.2;比较外周血、脾脏和头肾白细胞三种组织所发生的呼吸爆发的活性发现,脾脏白细胞的呼吸爆发活性最高,头肾略高于血液,感染8hr后呼吸爆发活性平均大于1.7;血清中细胞因子-白介素1β的OD490值从正常鱼对照的0.0523±0.014增长到感染24hr的最大值0.47±0.033,感染24 hr后的表达量大约是未感染对照的9倍,感染后增加量显著(p<0.05)。进一步证明感染初期先天性免疫应答防御在保护鱼体中的重要作用。SNARE蛋白是一种参与调控所有真核生物细胞分泌和胞吐的膜蛋白。为了测定SNARE蛋白是否也参与大菱鲆白细胞的分泌和胞吐,首先通过RT-PCR方法鉴定大菱鲆体内存在的SNARE蛋白,设计两种SNARE蛋白(v-SNARE,VAMP-2和t-SNARE,SNAP-25)基因的引物,从外周血白细胞和脑组织中都克隆出SNAREs蛋白中的VAMP-2的cDNA,而SNAP-25的cDNA仅从脑组织中克隆出。经过序列分析发现,大菱鲆的VAMP-2基因与多数哺乳动物的VAMP-2基因同源性在80%以上,而氨基酸序列的同源性在90.6%以上;大菱鲆SNAP-25基因与多数哺乳动物的SNAP-25基因也在83%以上,氨基酸序列的同源性在89%以上。结果表明这两种SNARE蛋白在大菱鲆体内也是非常保守。为了证明SNARE蛋白是否参与调控大菱鲆白细胞细胞因子白介素-1β的分泌,研究分泌调控蛋白-SNAREs在大菱鲆先天性免疫应答过程中的作用。通过RT-PCR,免疫印迹,免疫组化技术克隆了大菱鲆VAMP-2基因,并研究了其在细胞因子白细胞介素-1β分泌中的调控作用。

全文目录

摘要  8-10
ABSTRACT  10-13
1前言  13-47
  1.1 鱼类免疫机制研究进展  14-29
    1.1.1 鱼类免疫系统概述  14-16
    1.1.2 鱼类细胞因子－白介素－1β  16-22
    1.1.3 鱼类免疫机制研究进展  22-29
  1.2 SNAREs 蛋白在免疫应答中作用的研究进展  29-36
    1.2.1 SNAREs 蛋白在胞吐和分泌过程中的功能  29-33
    1.2.2 SNARE 蛋白参与调控免疫细胞的胞吐  33-36
  1.3 T淋巴细胞中钾离子通道的研究进展  36-46
    1.3.1 T 淋巴细胞中钾离子通道的结构和种类  36-41
    1.3.2 T 淋巴细胞中钾离子通道的表达变化  41-42
    1.3.3 T 淋巴细胞中钾离子通道的生理作用  42-46
  1.4 本研究的目的意义  46-47
2 大菱鲆(Scophthalmus maximus)抗鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染的免疫应答反应的研究  47-63
  2.1 材料与仪器  48-49
    2.1.1 仪器与设备  48-49
    2.1.2 材料与试剂  49
  2.2 实验方法  49-53
    2.2.1 大菱鲆血清和脾、头肾及血液白细胞的制备  49-50
    2.2.2 大菱鲆白细胞吞噬鳗弧菌活性的测定  50-51
    2.2.3 大菱鲆白细胞杀菌活性的测定  51
    2.2.4 大菱鲆白细胞呼吸爆发活性的测定  51-52
    2.2.5 大菱鲆血清中促炎症细胞因子IL-1β含量的测定  52-53
    2.2.6 大菱鲆淋巴细胞增殖测定  53
  2.3 结果  53-58
    2.3.1 大菱鲆白细胞吞噬鳗弧菌活性  53-54
    2.3.2 大菱鲆白细胞杀菌活性  54-55
    2.3.3 大菱鲆呼吸爆发活性  55-56
    2.3.4 大菱鲆细胞因子IL-1β分泌  56-57
    2.3.5 大菱鲆淋巴细胞增殖  57-58
  2.4 讨论  58-61
  2.5 结论  61-63
3 大菱鲆 SNARE 蛋白基因的克隆和序列分析  63-88
  3.1 材料与仪器  65
    3.1.1 仪器与设备  65
    3.1.2 材料与试剂  65
  3.2 实验方法  65-70
    3.2.1 大菱鲆SNARE 基因扩增引物设计  65-66
    3.2.2 RNA 的提取  66
    3.2.3 cDNA 合成  66-67
    3.2.4 PCR 扩增  67
    3.2.5 PCR 产物克隆  67-68
    3.2.6 测序结果验证  68-69
    3.2.7 序列分析  69-70
  3.3 结果  70-85
    3.3.1 RNA 的提取  70-71
    3.3.2 PCR 扩增结果  71-72
    3.3.3 测序结果  72-76
    3.3.4 同源性分析  76-77
    3.3.5 一级结构分析  77-80
    3.3.6 二级结构预测  80-83
    3.3.7 三维结构预测展示  83-84
    3.3.8 疏水性分析  84-85
  3.4 讨论  85-87
  3.5 结论  87-88
4大菱鲆 VAMP-2蛋白参与细胞因子 IL－1β分泌的调控  88-101
  4.1 材料与仪器  89-90
    4.1.1 仪器与设备  89
    4.1.2 材料与试剂  89-90
  4.2 实验方法  90-93
    4.2.1 鳗弧菌免疫鱼体  90
    4.2.2 血清和白细胞的制备  90-91
    4.2.3 血清中IL-1β含量的测定  91
    4.2.4 IL-1β和 VAMP-2 的 RT-PCR  91-92
    4.2.5 VAMP-2 的免疫印迹  92-93
    4.2.6 VAMP-2 的激光共聚焦显微镜扫描  93
  4.3 结果  93-98
    4.3.1 受感染鱼白细胞IL-1β分泌  93-95
    4.3.2 VAMP-2 基因在大菱鲆白细胞中表达  95-96
    4.3.3 受鳗弧菌刺激的鱼体白细胞中 VAMP-2 蛋白的表达量增加  96-97
    4.3.4 VAMP-2 定位于大菱鲆白细胞的分泌小泡上  97-98
  4.4 讨论  98-100
  4.5 结论  100-101
5 大菱鲆钾离子通道参与调控淋巴细胞增殖的研究  101-115
  5.1 材料与仪器  101-102
    5.1.1 仪器与设备  101-102
    5.1.2 材料与试剂  102
  5.2 实验方法  102-105
    5.2.1 MTT 法检测钾离子通道阻断剂 TEA 和4-AP 对鳗弧菌感染72 小时后大菱鲆外周血淋巴细胞增殖的影响  102-103
    5.2.2 鳗弧菌感染前后大菱鲆外周血淋巴细胞钾离子通道变化的检测  103-105
  5.3 结果  105-112
    5.3.1 淋巴细胞的贴壁  105-106
    5.3.2 通道阻断剂 TEA 和 4-AP 对淋巴细胞增殖的影响  106-109
    5.3.3 受鳗弧菌感染前后大菱鲆淋巴细胞钾离子通道特性  109
    5.3.4 通道阻断剂 TEA 和 4-AP 对淋巴细胞钾离子通道的影响  109-112
  5.4 讨论  112-114
  5.5 结论  114-115
本论文创新点  115-116
发表文章  116-117
参考文献  117-142
致谢  142

SNAREs蛋白和钾离子通道蛋白参与调节大菱鲆免疫应答

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