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逆转录酶抑制剂膦甲酸钠用于治疗乙型肝炎病毒感染的理论与实践

作　者: 韩燕星
导　师: 蒋建东；薛荣
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 乙型肝炎病毒感染放射性核素抑制剂辣根过氧化物酶聚合酶操作过程膦甲酸钠联合用药高效抗逆转录病毒疗法逆转录酶
分类号: R512.62
类　型: 博士论文
年　份: 2005年
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内容摘要

具有逆转录特征的生物酶广泛存在于乙型肝炎病毒（HBV）、人类T淋巴细胞病毒（HTLV）、鼠乳腺癌病毒（MMTV）、人类自身免疫缺陷病毒（HIV）、花椰菜花叶病毒（CaMV）、劳氏肉瘤病毒（RSV）等多种动植物病毒中，它们对人类的自身健康和生产生活产生了巨大的不良影响。针对逆向转录酶（RT）的药物研究具有广泛的重要意义。通常情况下，药物研发过程必须要设计出适合于高通量筛选的靶位模型。传统的RT活性的³H掺入检测法由于其操作过程复杂和放射性核素使用方面固有的缺陷，已不能满足当前的需要，而且难以发展成为高通量或半高通量的筛选技术。我们在国内首次构建了RT活性的ELISA检测法，应用预先包被于Covalink 96孔板的poly（A）模板和不同来源的RT将生物素标记的dUTP掺入，用辣根过氧化物酶反应系统检测酶活性，在一定时间范围内，反映酶活性的OD值的大小与时间呈线性关系。通过与放射性核素掺入检测法进行比较，显示两种方法有明显的一致性（HIV-1 RT：r²=0.997）。应用ELISA法检测奈韦拉平（NVP）、膦甲酸钠（PFA）对HIV-1 RT活性的抑制作用，显示出药物作用的剂量依赖性，测得IC₅₀分别为0.23±0.12μg／ml、0.21±0.08μg／ml。同时，对ELISA法的重复性、稳定性及用于抑制剂研究的特异性和敏感性进行了评价，证明了应用ELISA法检测HIV-1 RT的活性具有简便、快速、重复性好、特异性强的特点，适用于抗HIV-1 RT药物的大样品量筛选工作，并可发展成为高通量技术。在成功构建HIV-1 RT ELISA检测方法的基础上，利用该方法，进一步检测了莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶（M-MLV-RT）、禽类成髓细胞瘤病毒逆转录酶（AMV-RT）及鸭乙型肝炎复制复合体（DHBV RCs）的活性，同时还检测了HIV-1感染细胞上清中RT的活性，证明ELISA法适用于具有逆转录特征的多种病毒酶的体外活性检测。随着高效抗逆转录病毒疗法（HAART）在艾滋病患者中的广泛应用，抗HIV感染的联合化疗取得了极大成功，HIV的传播得到了一定程度的控制，最新的研究表明，仅仅联合使用两个RT抑制剂如齐多夫定（AZT）和奈韦拉平（NVP）亦可使患者血液中HIV滴度降至检测不到的水平。然而，HBV感染的治疗却面临着相当的困境，1) 与抗HIV RT的药物相比，可供选择抗HBV RT的治疗药物十分有限；2) 伴随某种药物的长期单一应用，耐药病毒株不断出现。寻找新的不同机制的抗HBV药物，增加联合用药的候

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目录  3-5
中文摘要  5-8
英文摘要  8-11
缩略语表  11-13
前言  13-17
第一部分逆转录酶活性检测的ELISA方法构建  17-30
  引言  17
  实验材料  17-19
  实验方法  19-21
  实验结果  21-27
  讨论  27-29
  结论  29-30
第二部分 PFA用于抗乙型肝炎病毒感染  30-56
  引言  30
  实验材料  30-33
  实验方法  33-41
  实验结果  41-53
  讨论  53-56
第三部分 PFA与3TC联合治疗乙型肝炎的探索  56-63
  引言  56
  材料方法  56-59
  实验结果  59-62
  讨论  62-63
论文结论  63-64
参考文献  64-68
文献综述  68-82
发表论文及获奖情况  82-83
附件一已发表的论文  83-85
附件二 SCI论文  85-112
致谢  112

逆转录酶抑制剂膦甲酸钠用于治疗乙型肝炎病毒感染的理论与实践

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