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新杀虫剂啶虫脒对旱地土壤微生物生态影响及其降解研究

作　者: 姚晓华
导　师: 闵航
学　校: 浙江大学
专　业: 微生物学
关键词: 啶虫脒 微生物多样性 变性梯度凝胶电泳(DGGE) 氧化应激 生物降解 Pseudomonas sp.FH2
分类号: X53
类　型: 博士论文
年　份: 2005年
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内容摘要


本文以杭州临平灰潮土为研究材料,综合运用传统平板培养技术及现代分子生物学方法,全面地探讨了类烟碱型新杀虫剂啶虫脒对旱地土壤微生物生态及毒性效应,并筛选、分离和鉴定了一株啶虫脒降解菌,进行了啶虫脒降解途径的初步推测,为建立有效的杀虫剂污染预警指标体系、环境质量评价和啶虫脒降解菌的有效利用提供了有益的参考。本研究所获得主要结论如下: 1.采用传统平板培养方法研究了啶虫脒对旱地土壤好气性细菌、放线菌、真菌和固氮菌生长的影响及对土壤脱氢酶、过氧化氢酶、脲酶、磷酸酶、蛋白酶活性和土壤呼吸强度的影响。研究结果表明,四种施用浓度的啶虫脒均可以刺激细菌和真菌的生长。在使用啶虫脒后的两周内,好气性固氮菌数量被抑制,从第三周开始固氮菌数量回升,这种刺激的趋势一直持续到试验结束（50天）。啶虫脒对放线菌数量有抑制作用。在啶虫脒使用后第一周,各个浓度处理的放线菌数量均显著下降,抑制率达到了80%。在整个50天的试验培养期内,25、50mg kg-1干土两个高浓度土样的放线菌数量始终处于被抑制状态。 啶虫脒对过氧化氢酶和脲酶的影响不大,在整个试验过程中,处理土壤的这两种酶活性与对照土样的没有显著的差异。啶虫脒对土壤磷酸酶有明显的抑制作用。在施药的第一周,四个处理土样的磷酸酶活性均受到显著的抑制,且与浓度成正比。在大部分试验期内,25、50mg kg-1干土两个高浓度的处理土样的酶活始终显著小于对照水平。由磷酸酶的浓度效应非线性回归曲线计算出的第7天、14天、35天的EC10和EC50分别为28、15、31和146120、14636和13414mg kg-1干土。计算得出的EC10值比正常使用浓度（0.5mg k-1 干土）大得多,这表明在正常的使用浓度下,对磷酸酶不构成毒理学上的威胁。但是计算得出的EC10值小于试验所选择的最高浓度值（50mg kg-1 干土）,所以当啶虫脒在土壤中积累或者使用量不当时,对磷酸酶的威胁会增大。在啶虫脒处理土壤后的第一和第二周内,脱氢酶被轻微抑制,从第三周开始,低浓度（0.5mg kg-1、5mg kg-1 干土）处理土样的酶活首先被激活,此后各个处理土样脱氢酶活性继续被激活,激活的程度与施用浓度成反比。在啶虫脒处理后的三周内,蛋白酶活性变化与使用浓度没有明显关系,从第四周开始处理土样的蛋白酶活性均受到了不同程度的抑制,其中施用浓度为50mg kg-1 干土土样酶活性受到了显著的抑制（p<0.05）。 啶虫脒使用后第二周开始,土壤呼吸受到抑制,并且使用浓度越高,抑制效应就越明显。在试验后期,呼吸强度才开始缓慢恢复。由剂量效应非线性回归曲线计算得出的第21天的

全文目录


中文摘要  8-11
ABSTRACT  11-16
第一章 文献综述  16-40
  1.1 我国农药工业概况  16-17
  1.2 啶虫脒等烟碱类农药的发展  17-18
  1.3 农药对土壤生物活性的影响  18-23
    1.3.1 农药对土壤微生物数量的影响  19-21
    1.3.2 农药对土壤酶活性的影响  21-22
    1.3.3 农药对土壤呼吸作用的影响  22-23
  1.4 土壤微生物群落多样性研究方法及最新进展  23-32
    1.4.1 土壤微生物群落多样性的概念  23
    1.4.2 土壤微生物群落结构的研究方法  23-32
      1.4.2.1 以生物化学技术为基础的研究微生物多样性的方法  24-27
      1.4.2.2 以分子技术为基础的研究微生物多样性的方法  27-32
  1.5 农药的微生物降解  32-39
    1.5.1 可降解农药的微生物  32-35
    1.5.2 农药微生物降解的途径  35-36
    1.5.3 农药的降解酶及其相关的基因克隆与表达  36-39
  1.6 本研究的目的与意义  39-40
第二章 啶虫脒对旱地土壤微生物种群的影响  40-47
  2.1 材料与方法  41-42
    2.1.1 药剂  41
    2.1.2 供试土壤  41
    2.1.3 试验设计与实施  41-42
    2.1.4 培养基配方和计数方法  42
    2.1.5 数据处理  42
  2.2 结果与分析  42-45
    2.2.1 啶虫脒对土壤细菌数量的影响  42-43
    2.2.2 啶虫脒对土壤放线菌数量的影响  43-44
    2.2.3 啶虫脒对土壤真菌数量的影响  44-45
    2.2.4 啶虫脒对土壤好气性固氮菌数量的影响  45
  2.3 小结  45-47
第三章 啶虫脒对旱地土壤酶活性和呼吸强度的影响  47-57
  3.1 材料与方法  48-50
    3.1.1 药剂  48
    3.1.2 土壤  48
    3.1.3 试验设计与实施  48
    3.1.4 土壤酶活性的测定  48-50
      3.1.4.1 脱氢酶活性的测定  48
      3.1.4.2 过氧化氢酶活性的测定  48-49
      3.1.4.3 脲酶活性的测定  49
      3.1.4.4 磷酸酶活性的测定  49
      3.1.4.5 蛋白酶的测定  49-50
    3.1.5 土壤呼吸强度测定  50
    3.1.6 数据处理  50
  3.2 结果与讨论  50-55
    3.2.1 啶虫脒对旱地土壤脱氢酶活性的影响  50-51
    3.2.2 啶虫脒对旱地土壤过氧化氢酶活性的影响  51
    3.2.3 啶虫脒对旱地土壤磷酸酶活性的影响  51-53
    3.2.4 啶虫脒对旱地土壤蛋白酶活性的影响  53-54
    3.2.5 啶虫脒对旱地土壤脲酶活性的影响  54
    3.2.6 啶虫脒对旱地土壤呼吸作用的影响  54-55
  3.3 小结  55-57
第四章 啶虫脒对旱地土壤微生物多样性的DGGE分子指纹分析  57-76
  4.1 材料与方法  57-64
    4.1.1 药剂  57
    4.1.2 供试土壤  57-58
    4.1.3 试验设计与实施  58
    4.1.4 土壤总DNA的提取  58
    4.1.5 PCR扩增  58-60
    4.1.6 变性梯度凝胶电泳(DGGE)  60
    4.1.7 染色  60-61
    4.1.8 割胶回收  61
    4.1.9 指纹图谱分析  61
    4.1.10 克隆和序列分析  61-64
  4.2 结果与分析  64-75
    4.2.1 土壤DNA提取结果  64
    4.2.2 特异性引物的PCR扩增  64-65
    4.2.3 啶虫脒处理对旱地土壤微生物群落结构的影响  65-74
      4.2.3.1 啶虫脒处理第一周旱地土壤细菌群落结构的DGGE分析  65-67
      4.2.3.2 啶虫脒处理第二周旱地土壤细菌群落结构的DGGE分析  67-68
      4.2.3.3 啶虫脒处理第四周旱地土壤细菌群落结构的DGGE分析  68-70
      4.2.3.4 啶虫脒处理第五周旱地土壤细菌群落结构的DGGE分析  70-72
      4.2.3.5 啶虫脒处理第七周旱地土壤细菌群落结构的DGGE分析  72-74
    4.2.4 特异性条带的割胶回收与克隆  74-75
  4.3 小结  75-76
第五章 纯种细菌对啶虫脒胁迫的氧化应激反应研究  76-86
  5.1 材料与方法  77-79
    5.1.1 药品与试剂  77
    5.1.2 供试菌株  77
    5.1.3 培养基  77-78
    5.1.4 试验设计与实施  78
      5.1.4.1 不同浓度的啶虫脒对细菌的SOD、CAT和ATP酶活性的影响  78
      5.1.4.2 啶虫脒对已培养24h细菌的SOD、CAT和ATP酶的活性影响  78
    5.1.5 样品预处理及细胞蛋白质、SOD、CAT和ATP酶活性的测定  78-79
    5.1.6 PAGE活性染色法分析过氧化物歧化酶同工酶组成  79
    5.1.7 数据处理  79
  5.2 结果与讨论  79-84
    5.2.1 不同浓度啶虫脒对细菌中抗氧化酶和ATPase活性的影响  79-81
    5.2.2 细菌生长24h后加入啶虫脒对抗氧化酶活性和ATPase活性的影响  81-83
    5.2.3 PAGE电泳及活性染色观察啶虫脒对细菌SOD同工酶组成的影响  83-84
  5.3 小结  84-86
第六章 啶虫脒降解细菌的分离筛选、鉴定及其降解研究  86-101
  6.1 材料与方法  86-90
    6.1.1 样品及降解菌的富集、分离与纯化  86-87
    6.1.2 试剂  87
    6.1.3 分离菌株FH2的形态观察及生理生化特征  87
    6.1.4 分离菌株FH2的BIOLOG-GN鉴定  87
    6.1.5 分离菌株FH2 DNA中G+Cmol％测定  87-88
    6.1.6 分离菌株16S rDNA的PCR扩增、序列测定及系统发育分析  88-89
    6.1.7 抗生素敏感性试验  89
    6.1.8 分离菌株的生长、降解特性研究  89-90
      6.1.8.1 培养基初始pH值对FH2菌株生长的影响  89
      6.1.8.2 温度对FH2菌株生长的影响  89
      6.1.8.3 菌株FH2的生长降解特性  89
      6.1.8.4 添加酵母粉对菌株FH2生长和降解的影响  89-90
    6.1.9 分离菌株对啶虫脒降解产物的GC／MS测定  90
    6.1.10 啶虫脒诱导对FH2菌株全细胞蛋白组成的影响  90
  6.2 结果与讨论  90-99
    6.2.1 啶虫脒降解菌的形态特征  90-91
    6.2.2 啶虫脒降解菌的生理生化特性  91-93
    6.2.3 分离菌株DNA的G+Cmol％含量  93
    6.2.4 啶虫脒降解菌的16Sr DNA序列分析  93-94
    6.2.5 基于16S rDNA的系统发育树的构建  94-95
    6.2.6 抗生素敏感试验  95
    6.2.7 FH2菌株生长和降解特性  95-98
      6.2.7.1 培养基初始pH值对生长的影响  95-96
      6.2.7.2 培养温度对生长的影响  96
      6.2.7.3 菌株FH2对啶虫脒的降解动力学曲线  96-97
      6.2.7.4 酵母粉的添加对生长和降解的影响  97-98
    6.2.8 菌株FH2降解啶虫脒的产物GC／MS检测  98-99
    6.2.9 啶虫脒诱导对FH2菌株全细胞蛋白组成的影响  99
  6.3 小结  99-101
第七章 研究结论及展望  101-107
  7.1 全文主要研究结论  101-104
  7.2 展望  104-107
参考文献  107-118
致谢  118-120
博士研究生学习期间论文发表情况  120

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中图分类: > 环境科学、安全科学 > 环境污染及其防治 > 土壤污染及其防治
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