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参环毛蚓中抗栓活性蛋白酶的研究

作　者: 张东方
导　师: 杨松松
学　校: 辽宁中医学院
专　业: 生药学
关键词: 参环毛蚓(Pheretima aspergillum(E.Perrier)) 广地龙地龙溶栓蚓激酶
分类号: R284
类　型: 博士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

参环毛蚓Pheretima aspergillum(E.Perrier)为钜蚓科Megascolecidae环毛属Pheretima动物。习称地龙的学位论文">广地龙，为常用中药，中药地龙在中国药典中收录的品种还有通俗环毛蚓Pherefima Vulgaris chen，威廉环毛蚓Pheretima guillelmi(Michaelsen)，栉盲环毛蚓Pheretimapectinifera Michaelsen的干燥体。后三者习称为“沪地龙”。性寒，味咸，归肝、脾、膀胱经。具有清热息风、通经络、平喘、利尿之功效。主治高热惊痫，气虚血滞，半身不遂，肺热哮喘，小便不利及热痹等证。通过对参环毛蚓及赤子爱胜的对比研究，从活性对比研究中可以看出，两种蚯蚓在纤维平板试验中均具有纤溶活性，并且活性大小相近，从酶谱研究来看，两种蚯蚓所含蛋白质分子量相近，但也有一定差别，通过PCR分析，二者亲缘也相对较近，临床上应用的蚯蚓产品，经过研究表明也是相对较粗的产品。本文对参环毛蚓中的溶栓活性成分进行了较为深入的研究，以对凝血时间为指标跟踪其中的活性成分，用盐析法、膜分离法、CM-sepharose、DEAE-sephadex-A50、sephacryl-S200、sepharose EE等凝胶层析，分离纯化广地龙中溶栓活性成分，得到5个蛋白酶，其中一个蛋白酶具有较强活性，并用聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)进行了分子量测定分别为：＞97000、60500、47900、28100、26300，用氨基酸自动分析仪分析了其中的氨基酸组成，通过氨基酸序列分析仪分析了N端基序列等相关数据测定，其N端序列为Gln-Ile-Gly-Gly-Thr-Asn-Ala-Ser-Pro-Gly-Glu-Phe-Pro-Pro-Gln-Leu-Ser-Gln-Thr。确立了参环毛蚓药材的质量标椎。以纤溶活性溶圈大小为指标，对参环毛蚓进行提取工艺考察，并对提取物进行了包括活性、指纹图谱质量标准研究。并对参环毛蚓提取物以动-静脉旁路模型实验进行了体内抗栓研究。

全文目录

摘要  5-6
英文摘要  6-7
中英文对照  7-8
前言  8-9
第一章蚯蚓的文献研究  9-14
  第一节蚯蚓的本草考证  9
  第二节蚯蚓的现代研究  9-13
  第三节讨论  13-14
第二章参环毛蚓与赤子爱胜蚓的对比研究  14-33
  第一节活性对比研究  14-16
  第二节酶谱的对比研究  16-20
    1 电泳的酶谱对比研究  16-17
    2 HPLC法酶对比研究  17-20
  第三节脂溶性成分的对比研究  20-25
  第四节参环毛蚓与赤子爱胜蚓的RAPD分析  25-29
  第五节国内市场蚓激酶制剂调查  29-30
  第六节结论与讨论  30-33
第三章参环毛蚓的提取工艺研究及提取物的质量标准研究  33-49
  第一节参环毛蚓的提取工艺研究  33-37
    一. 参环毛蚓的细胞破碎方法考察  33
    二. 提取工艺考察  33-35
    三. 参环毛蚓中抗栓活性蛋白酶的分离  35-37
  第二节参环毛蚓提取物质量标准研究  37-49
    一. 含量测定  37-40
    二. 凝血时间效价  40-41
    三. 纤溶活性的测定  41-44
    四. 参环毛蚓提取物电泳指纹图谱研究  44-49
第四章参环毛蚓中抗栓活性蛋白酶的研究  49-114
  第一节参环毛蚓中蛋白酶的分离与纯化  49-58
  第二节纯度检查  58-68
  第三节理化测试  68
  第四节效价测定  68-70
    一. 含量测定  68-69
    二. 比活测定  69-70
  第五节外加因素对酶活性的影响  70-72
    一. 消化液对酶活性的影响  70-71
    二. PH值对酶活性的影响  71
    三. 温度对酶活性的影响  71
    四. 结论与讨论  71-72
  第六节分子量的测定  72-79
  第七节氨基酸分析  79-92
  第八节 N-端氨基酸序列测定分析  92-114
    一. Edman degmdation的工作原理  92-94
    二. 实验部分  94
    三. 讨论  94-114
第五章参环毛蚓的药材质量标准研究  114-121
  起草说明  116
  第一节参环毛蚓的溶栓活性部位考察  116-117
  第二节参环毛蚓的干燥方法考察  117-118
  第三节参环毛蚓的鲜品与市场干品电泳比较  118-119
  第四节不同批次商品地龙的学位论文">广地龙的抗栓活性测定  119-120
  第五节参环毛蚓的初步稳定性研究  120-121
第六章参环毛蚓提取物的药效学研究  121-123
创新点  123-124
参考文献  124-127
致谢  127-128
简历  128-129
综述  129-134

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