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维拉帕米代谢的微生物模型研究
作 者: 孙璐
导 师: 钟大放
学 校: 沈阳药科大学
专 业: 药物分析学
关键词: 维拉帕米 蔡普生 甲苯磺丁脲 微生物模型 代谢产物 LC/MS~n方法
分类号: R96
类 型: 博士论文
年 份: 2003年
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内容摘要
本文的主要目的是以维拉帕米为模型药物,考察微生物模型和哺乳动物在药物代谢方面的异同,探讨采用微生物模型部分替代哺乳动物进行药物代谢研究的可行性;制备微生物微粒体并进行体外孵化实验,直接证明了维拉帕米在微生物模型中的Ⅰ相代谢反应是由菌体内的CYP450酶催化的,从亚细胞水平阐述了微生物模型能够模拟哺乳动物药物代谢的物质基础;利用微生物模型制备萘普生和甲苯磺丁脲的代谢产物,考察微生物模型用于制备药物代谢产物的通用性。 一、维拉帕米在微生物模型中的代谢研究 通过菌株筛选实验,考察了13株真菌对维拉帕米的转化能力,其中短刺小克银汉霉AS 3.153对维拉帕米的转化比较完全,且代谢产物种类多,因此将其选作模型微生物,用于维拉帕米的代谢研究。按照优化的条件(培养基初始pH 6.5、底物浓度0.75 mg/mL和转化时间72 h)进行制备规模转化,采用半制备反相高效液相色谱法分离纯化代谢产物。通过核磁共振光谱和电喷雾离子化质谱进行结构鉴定,制备得到的5种维拉帕米代谢产物的化学结构分别为30-O-去甲基维拉帕米、20-O-去甲基维拉帕米、N-去甲基维拉帕米、α-(3-甲氨基丙基)-3,4-二甲氧基-α-异丙基苯乙腈(N-去苯乙基部分代谢产物)和N-甲基-3,4-二甲氧基苯乙胺(N-去苯乙腈部分代谢产物),可将它们作为代谢产物对照品用于维拉帕米的代谢研究。 采用液相色谱-多级质谱联用(LC/MS~n)方法对维拉帕米及其5种代谢产物进行质谱分析,总结得到以下规律:(1)结构中都含有一个碱性较强的氮原子,电喷雾离子化条件下采用正离子检测方式灵敏度较高;(2)一级全扫描质谱中只检测到准分子离子[M+H]~+,没有出现多聚体离子或其他加合离子,也没有出现明显的热裂解碎片离子;(3)化学键断裂主要集中在碱性氮原子附近,α键裂解只发生在较长的烷基侧链,没有出现脱去N-甲基的碎片离子;(4)碎片离子主要来源于一个键的断裂。也能检测到由两个键断裂所形成的碎片离子,但相应的离子强度较弱;(5)结构中苯乙基部分未发生变化的化合物,在二级全扫描质谱中的基峰离子为含有苯乙基部分的碎片离子;这部分结构如果发生改变,则基峰离子为含有苯乙腈部分的碎片离子;(6)发生N-去甲基反应和N-去烷基反应生成的代谢产物,均出现脱去异丙基自由基的碎片离子。以上质谱断裂规律可作为判断依据,由维拉帕米代谢产物的多级质谱碎片离子,确定其结构中的苯乙腈部分、苯乙基部分和N-烷基部分是否发生变化,以推测代谢产物的化学结构。 采用LC/MS~n方法首次研究了维拉帕米在微生物模型中的代谢情况。发现维维拉帕米代谢的微生物模型研究拉帕米在短刺小克银汉霉AS 3.153微生物模型中代谢广泛,共生成23种代谢产物。综合分析每种代谢产物的准分子离子、多级碎片离子和色谱保留时间,并与维拉帕米及制备的5种代谢产物对照品进行比较,鉴定代谢产物的化学结构分别为口一去甲基代谢产物(VMI一VM3),N-去甲基代谢产物(VM4),双去甲基代谢产物(VMS一VMS),N-去烷基代谢产物(VMg和VM10),N-去烷基后单去甲基代谢产物(VMll和 VM12),单去甲基代谢产物的硫酸结合物(VM13一VM 15)和双去甲基代谢产物的硫酸结合物(VM16~VM23)。维拉帕米在微生物模型中主要经历4种代谢途径,包括:O一去甲基、N-去甲基、N-去烷基和硫酸结合。上述途径还可能发生交又,生成次级代谢产物。二、维拉帕米在哺乳动物体内的代谢研究 在有关文献报道的基石出上,采用LC侧Sn方法研究了维拉帕米在人、比格犬和大鼠体内的代谢情况。 健康受试者口服盐酸维拉帕米80 mg后,收集不同时间的血浆样品和尿样进行分析,共发现了28种代谢产物。其中9种为已知代谢产物,巧种为首次发现的代谢产物,还有4种代谢产物为文献中尚未确定结合物类型的H相代谢产物,本文确定了它们的化学结构。维拉帕米在人体内代谢生成O-去甲基代谢产物 (VMI~VM3和VM24),N-去甲基代谢产物(VM4),双去甲基代谢产物 (VMS、VM7、VMS和VM25),N-去烷基代谢产物(VMg和VM10),N-去烷基后单去甲基或双去甲基代谢产物(VM 11、VM12和VM26),O一去甲基代谢产物的葡萄糖醛酸结合物(VM27一VM35)和O-去甲基代谢产物的硫酸结合物(VM 15、VM20、VM36一vM38)。综合以上研究结果,维拉帕米在人体内有5种主要代谢途径,包括:0一去甲基、N-去甲基、N-去烷基、葡萄糖醛酸结合及硫酸结合,而且这些代谢途径还可能发生交叉,生成次级代谢产物。比格犬与人体内的代谢情况相似,只缺少了1种O一去甲基代谢产物(VM24)和3种硫酸结合物(VMZO、VM36和VM38)。 在大鼠体内发现了5种人和比格犬体内未检测到的代谢产物,分别是22,30-O一双去甲基维拉帕米(VM6)、32一口一去甲基子人去甲基维拉帕米( VM39)以及它们的葡萄糖醛酸结合物(VM41和VM42)和32一O-去甲基维拉帕米的葡萄糖醛酸结合物(VM40),均为首次发现。三、维拉帕米在微生物模型和哺乳动物体内的代谢产物比较 维拉帕米在短刺小克银汉霉AS 3.153微生物模型和哺乳动物(包括人、比格犬和大鼠)体内都进行了广泛代谢,分别生
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全文目录
摘要 9-13 ABSTRACT 13-17 缩略语说明 17-18 第一章 绪论 18-28 1.1 药物代谢研究方法 18-20 1.1.1 体内研究方法 18-19 1.1.2 体外研究方法 19-20 1.2 哺乳动物药物代谢的微生物模型研究 20-22 1.3 液相色谱-质谱联用技术在药物代谢研究中的应用 22-25 1.4 维拉帕米的代谢研究情况 25-27 1.5 本文的研究目标及主要技术路线 27-28 第二章 维拉帕米在微生物模型中的代谢研究 28-73 2.1 建立转化维拉帕米的微生物模型 28-30 2.1.1 菌株筛选实验 28-29 2.1.2 样品分析方法 29 2.1.3 菌株筛选结果 29-30 2.2 转化条件优化 30-33 2.2.1 培养基初始pH值 30-31 2.2.2 底物浓度 31-32 2.2.3 转化时间 32-33 2.3 制备维拉帕米的代谢产物 33-47 2.3.1 制备规模转化 34 2.3.2 半制备高效液相色谱法 34 2.3.3 维拉帕米代谢产物的结构鉴定 34-46 2.3.4 维拉帕米及其代谢产物的ESI质谱断裂规律 46-47 2.4 维拉帕米在微生物模型中的代谢研究 47-69 2.4.1 微生物模型转化样品 47 2.4.2 微生物模型中代谢产物的结构鉴定 47-69 2.4.3 维拉帕米在微生物模型中的代谢途径 69 2.5 讨论 69-73 2.5.1 利用微生物模型制备药物代谢产物 69-72 2.5.2 维拉帕米及其代谢产物的色谱行为 72-73 第三章 维拉帕米在哺乳动物体内代谢研究以及与微生物模型的比较 73-131 3.1 样品分析方法 73 3.2 维拉帕米在人体内的代谢产物鉴定 73-98 3.2.1 生物样品 73-74 3.2.2 人体内代谢产物的结构鉴定 74-94 3.2.3 维拉帕米在人体内的代谢途径 94-98 3.3 维拉帕米在比格犬体内的代谢产物鉴定 98-109 3.3.1 生物样品 98 3.3.2 比格犬体内代谢产物的结构鉴定 98-106 3.3.3 维拉帕米在比格犬体内的代谢途径 106-109 3.4 维拉帕米在大鼠体内的代谢产物鉴定 109-127 3.4.1 生物样品 109 3.4.2 大鼠体内代谢产物的结构鉴定 109-122 3.4.3 维拉帕米在大鼠体内的代谢途径 122 3.4.4 不同给药方式对大鼠尿样中代谢产物的影响 122-127 3.5 讨论 127-131 3.5.1 维拉帕米在微生物模型与人体内的代谢产物比较 127 3.5.2 维拉帕米在微生物模型与实验动物体内的代谢产物比较 127-129 3.5.3 维拉帕米代谢的种属差异 129-131 第四章 维拉帕米在微生物微粒体和哺乳动物肝微粒体中的代谢研究 131-144 4.1 制备微生物微粒体 131-132 4.1.1 菌体培养 131 4.1.2 制备微生物微粒体 131-132 4.2 制备犬和大鼠肝微粒体 132 4.2.1 实验动物 132 4.2.2 制备犬和大鼠肝微粒体 132 4.3 微粒体中蛋白浓度和CYP450酶含量测定 132-134 4.3.1 蛋白浓度测定 132-133 4.3.2 CYP450酶含量测定 133-134 4.4 微粒体孵化实验 134 4.5 维拉帕米在微粒体中的代谢研究 134-140 4.5.1 维拉帕米在微生物微粒体中的代谢研究 134-137 4.5.2 维拉帕米在犬肝微粒体中的代谢研究 137-139 4.5.3 维拉帕米在大鼠肝微粒体中的代谢研究 139-140 4.6 讨论 140-144 4.6.1 微生物的CYP450酶 140-142 4.6.2 维拉帕米在微粒体中与生物体内的代谢产物比较 142-143 4.6.3 底物浓度对维拉帕米在微粒体中代谢的影响 143-144 第五章 利用微生物模型制备其他药物的代谢产物 144-168 5.1 制备萘普生的代谢产物 144-155 5.1.1 萘普生的代谢研究情况 144-145 5.1.2 建立转化萘普生的微生物模型 145-148 5.1.3 转化条件优化 148-150 5.1.4 制备萘普生的代谢产物 150-151 5.1.5 萘普生代谢产物的结构鉴定 151-154 5.1.6 静息细胞培养法 154-155 5.2 制备羟基甲苯磺丁脲 155-165 5.2.1 甲苯磺丁脲的代谢研究情况 155-156 5.2.2 建立转化甲苯磺丁脲的微生物模型 156-159 5.2.3 转化条件优化 159-161 5.2.4 制备甲苯磺丁脲的代谢产物 161 5.2.5 甲苯磺丁脲代谢产物的结构鉴定 161-163 5.2.6 静息细胞培养法 163-165 5.3 讨论 165-168 5.3.1 萘普生在不同微生物模型中的代谢差异 165-166 5.3.2 静息细胞培养法在微生物模型中的应用 166 5.3.3 影响微生物模型转化结果的几个因素 166-168 第六章 实验部分 168-173 6.1 药品和试剂 168 6.2 仪器和设备 168-169 6.3 微生物模型转化实验 169-170 6.3.1 实验菌株 169 6.3.2 培养基 169-170 6.4 维拉帕米体内代谢实验 170-171 6.4.1 健康受试者血浆和尿样的采集 170 6.4.2 大鼠尿样和粪样的采集 170 6.4.3 大鼠血浆样品的采集 170-171 6.4.4 大鼠胆汁样品的采集 171 6.4.5 比格犬血浆和尿样的采集 171 6.4.6 酶水解实验 171 6.5 微粒体孵化实验 171-172 6.5.1 制备微生物微粒体的溶液配制 171-172 6.5.2 制备犬和大鼠肝微粒体的溶液配制 172 6.6 维拉帕米及其代谢产物的质谱响应比较 172-173 第七章 结论 173-175 参考文献 175-186 致谢 186-187 附图 187-195 个人简历 195-196
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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药理学
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