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小檗胺抗白血病作用及其机制的体外及体内实验研究

作　者: 吴东
导　师: 林茂芳
学　校: 浙江大学
专　业: 内科学
关键词: 小梁胺凋亡白血病细胞凋亡相关基因 bax基因 bcl－2基因 survivin基因 her／abl基因 bcR／ABL融合蛋白质裸小鼠异种移植
分类号: R733.7
类　型: 博士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

白血病是一类临床常见的造血系统恶性肿瘤，现代常规治疗方法的效果已达到一平台期，大部分患者由于不能耐受化疗药物的毒副作用或因白血病细胞对化疗药物的耐药而导致治疗失败，因此开发针对白血病细胞特异性靶点的高效低毒的新药，研究新的治疗模式，成为目前白血病研究的重要方向。小檗胺（Berbamine，BER）是从我国中草药小檗属（Berberis）植物中提取的一种双苄基异喹啉类生物碱。研究表明，小檗胺及其衍生物均属钙调素拮抗剂（Calmodulin antagonist），对多种实体肿瘤细胞株（如肝癌，宫颈癌，黑色素瘤等）细胞具有明显的增殖抑制作用，并呈剂量依赖关系。Dong Y及Ji ZN等发现，小檗胺还对白血病细胞株HL60细胞有诱导凋亡作用，并认为抑制端粒酶活性及bc1-2基因的表达可能在其中起作用。但小檗胺对其它类型白血病细胞的作用及其机制的有关研究结果尚未见报道。本研究试图初步阐明小檗胺抗白血病的作用及其可能的作用机制。利用建立的人白血病裸鼠异种移植模型，在体外与体内研究小檗胺对多种类型白血病细胞的作用，明确小檗胺是否能诱导多种白血病细胞凋亡以及多种凋亡相关基因在其诱导细胞凋亡中的作用，为小檗胺有可能开发成为新型的抗白血病药物，并应用于临床治疗，提供实验和理论依据。我们首先采用MTT法测定小檗胺对人慢粒急变细胞株K562细胞、T淋巴瘤细胞株Jurkat细胞、急性粒细胞白血病细胞株HL60细胞及急性早幼粒白血病细胞株NB4细胞等4种细胞的增殖抑制作用，并计算其各自的IC₅₀值（72h）。结果显示小檗胺对4种细胞均有明显的增殖抑制作用，并呈时间-浓度依赖关系。8.0μg／ml BER作用24、浙江大学博士学位论文抽昙48、72 h对K562细胞的储u率分别为 26．63％土3．57％，61．84％上4．74％，75．32％土1．95％；对Jurkat细胞的抑制率分别为26．77％上5．30％，44．48％土8．05％，70．31％上2．6删。比60、贴4细胞小细同样敏，4．0、8．0、16．opg／ml邵R作用uh，对HL60细胞的储u率分别为43．67％土1．94％、56．77％士4．45％、79．26％土2．28％；对NB4细胞的抑制率贝吩别为46．07％i 3．72％、85．ZI％上0．78％、92．26％士1．73％（与对照组相比，尸值均＜0．05）。上述 4种细胞的 72 h半数抑制浓度 ICs；，分别为 5．227土1．307 ug／ml、3．893土1．207ug／ml、5．926士1．03lug加及3．769上1．319ug／ml。但小案胺对正常骨髓单个核细胞的抑制作用极小，8．oug加 BER作用72 h的抑制率小于1．0％，ICU；值为103．650士10．257卜g／ml，约是上述白血病细胞株的17 5－27．5倍。上述结果提示，小梁胺具有较广谱的抗白血病细胞的作用，白血病细胞对小梁胺的敏感性明显地高于正常骨髓单个核细胞。本研究在光学显微镜及透视电镜下均观察到经小梁胺作用后的细胞具有典型的凋亡形态学改变；DNA电泳显示典型的“ DNA梯形带”；经流式细胞促检测到明确的凋亡峰。与同浓度点对照组相比，8。oug加 BER处理 72 h后，K％z细胞凋亡率明显地增加（61．77％士4．35％。O．SO％士0．N％，八0．OI），而经不同浓度断R作用24h后，随着药物浓度增加，凋亡率也相应提高，由2．口卜g砌1组的4．27％土0．58％上千至8．0卜yml组的29．20％士3．＊％。同样，在小梁胺处理后的人r＊t及贴9细胞中，也检测到明确的凋亡峰。经 8．opg加l BER处理 72 h后，凋亡率分别高达64．80o士 5．87O及 67．53O土 3．79o，与同浓度点对照组相比均有显著性差异（HO．of）。以上结果表明，小梁胺除对己报道的HL60细胞外，还能显著地诱导其它类型的白血病细胞凋亡（如 K562、Jurkat、NB4细胞），并呈明显的浓度一时间依赖关系。本研究通过 RT－PCR方法检现 Ks6z、Jurkat细胞 bax、hcf－2、survivln及h／abl等凋亡相关基因表达，采用 Western blotting方法检测 K茄z细胞BCR八BL融合蛋白质已。冰平。结果显示，小梁胺作用于 Jurkat细胞后，可显著上调其 bax／bclZ表达的比值，其中以促进bax的表达为主，而抑制be12的表达则相对较弱、经8．0卜m／ml BER处理 72 h，与同浓度点对照组相比，72 h组的 bax相对表达量（与内 2 浙江大学博士学位论文钩县参p－actin的比值）明显上门．60f0．01。0．93t0．of，HO．of太经不同浓度 BER处理 24 h后，b。12的表达随浓度增加则略有下降，但与未加药对照组相比， 16．0卜g加组b－2的表达才开始出现下调（1．20土0．01．50i0．05，HO．01）。我们首次发现凋亡抑制基因survivin在Kssz及Jurkat细胞中的表达量亦随小蔡胺作用浓度增加和时间延长而下调。8．oug加l BER处理 12h刁2h后，随作用时间延长，K％z细胞 survivin mRNA的相对表达量（与内参照今actin的比值）逐渐下降，与同浓度点对照组相比，在 72 h组，survivin。RNA明显地减弱(0．69土0．02 sl．09 土0．01，HO

全文目录

中文摘要  4-8
英文摘要  8-12
论文正文  12-77
  前言  12-14
  第一部分小檗胺影响人白血病细胞株细胞增殖的体外实验研究  14-22
    材料与方法  15-17
    结果  17-20
    讨论  20-22
  第二部分小檗胺诱导人白血病细胞株细胞凋亡及其机制的体外实验研究  22-55
    材料与方法  23-31
    结果  31-51
    讨论  51-55
  第三部分高成瘤人白血病细胞株裸鼠异种移植模型的建立及小檗胺在荷瘤裸鼠体内的抗白血病作用的研究  55-73
    材料与方法  56-59
    结果  59-70
    讨论  70-72
    小结  72-73
  参考文献  73-77
综述  77-97
  Ⅰ 钙调素拮抗剂小檗胺及其衍生物抗肿瘤作用的研究进展  77-87
  Ⅱ 造血干细胞基因治疗新进展  87-97
致谢  97

小檗胺抗白血病作用及其机制的体外及体内实验研究

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