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大肠脱落细胞及其突变基因检测在大肠癌诊断中的意义

作　者: 范如英
导　师: 李世荣；吴霞；晨智敏
学　校: 第三军医大学
专　业: 消化内科学
关键词: 结直肠肿瘤粪便脱落细胞 p53蛋白 APC基因突变 K-ras 基因突变检测
分类号: R735.34
类　型: 博士论文
年　份: 2001年
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内容摘要

大肠癌为人类常见的恶性肿瘤之一，早期发现、早期诊断是提高患者生存率的关键。对高危人群的筛查为大肠癌早期发现的重要手段。目前大肠癌筛查及早期诊断的常用方法为粪隐血试验及结肠镜检查，粪隐血试验是一种无创筛查手段，但它存在假阳性及假阴性过高的缺陷。结肠镜检查虽然是大肠癌诊断的金标准，但它一定的创伤且费用较高，难以成为第一线的筛查手段。人类大肠上皮细胞更新快，每3天-4天更新1次，脱落的上皮细胞随粪便排出体外，因此粪便中脱落细胞及其突变基因的检测可能成为大肠癌筛查及早期诊断的另一无创途径。本文旨在探讨粪便中脱落细胞及其DNA的提取方法；了解脱落细胞及其相关基因检测在大肠癌诊断方面的意义。方法1粪便中脱落细胞提取方法的改进研究对象：31例均经病理证实为大肠腺癌的患者。方法：分别采取密度梯度磁珠法及改良的淘洗法。淘洗法参考Iyengar建立的离心淘洗法并加以改进。（1）采集新鲜成形粪便3-5g或水样便50-100ml；（2）加入100ml MEM细胞营养液，营养液中另含PN 500u/L，SM 500mg/L，庆大霉素50mg/L，二性霉素B 1.25mg/L，BSA 10g/L，N-乙酰半胱氨酸5mmol/L；（3）搅拌混合；（4）经孔径600μm筛网过滤，滤液中加入过饱和量的硼酸以溶解粪便中的粘液，依次经孔径150μm和76μm筛网过滤；（5）1500转/分，室温，离心10分钟；（6）弃上清，沉淀用5ml0.9％的生理盐水重悬，加入20ml 95％的乙醇，经孔径 50卜 m筛网过滤：（）将滤液 1500转／分，室温，离心 10分钟；侣）弃上清，取沉淀涂片。涂片经95％的乙醇固定10分钟，常规HE染色，光镜下观察。兔疫磁珠法参考 Loktonov A创建的方法进行。2．粪便中脱落细胞学检测研究对象：经病理证实的大肠恶性肿瘤患者47例，其中腺癌46例，大肠恶性淋巴瘤1例。大肠非恶性肿瘤！33例，包括健康者50例，溃疡性结肠炎 18例，其它慢性肠炎 19例，腺瘤性息肉患者 26例，胃癌患者 16例，食道癌 4例。进行脱落细胞检测的同时进行粪免疫隐血试验吓OBT人方法：脱落细胞的提取方法采用前述淘洗法。3．粪便中脱落细胞DNA含量分析研究对象：大肠癌组为33例大肠腺癌患者。非癌组共30例，其中健康者10例，大肠腺瘤性息肉10例，溃疡性结肠炎10例。方法：脱落细胞进行常规Feulgen染色，光镜下400倍摄取图象，经计算机图象分析系统分析统计，计算所测定细胞的DNA含量、核面积、核异形指数及）5倍体（SC）细胞百分率。每例患者测定20个淋巴细胞为标准对照。大肠癌组共检测细胞676个，非癌组检测细胞607个。个癌组织及其粪便中脱落细胞中p53蛋白表达研究对象：38例大肠癌患者的癌组织及其中的30例患者的大肠脱落细胞。方法：采用链霉菌抗生物素蛋白－过氧化酶（S－P）法。5 大肠癌组织及粪便中Kras及APC突变基因检测5．IK－raslZ、13密码子突变检狈研究对象：23例大肠癌患者的癌组织及其中9例患者的正常大肠粘膜及10例患者的粪便。方法：组织中DNA提取采用常规酚、氯仿抽体法。DNA提取采用酚、氯仿反复抽提及乙醇沉淀法。突变体检测采用PCR－RFLP银染技术。5．2 APC基因 MCR区突变检测 x 研究对象：22例大肠癌患者的癌组织及其中9例患者的正常大肠粘膜及10例患者的粪便。方法：DNA提取同K寸as检测。设置A、B、C、D四对引物对APC基因MCR区进行交错重叠PCR扩增，对扩增产物采用SSCP银染技术进行鉴定。结果1 免疫磁珠法及淘洗法检测结果淘洗法与兔疫磁珠法对大肠癌的阳性检出率存在差异显著性比3．87％vs 38尸1％，P＜0刀1）。2 粪便中脱落细胞学检测脱落细胞检出情况为：大肠恶性肿瘤患者中检出重度异型增生5例，可疑癌 4例，癌 26例，恶性淋巴瘤 1例。其余 11例未发现异型细胞，脱落细胞检查对大肠恶性肿瘤（其中包括1例恶性淋巴瘤）检测敏感性为76．．60OO6／47）。对大肠癌检测敏感性为76．090臼5付6），大肠癌脱落细胞检测敏感性与癌组织的部位、肿瘤大小及形态均无关u分别＞o．仍入与DukeS分期、组织的分化、淋巴结转移也无相关性u分别＞0 OJ人20例 D血SA期及 B期患者阳性检出率为 750门人脱落细胞学对大肠癌的特异性为98．50％＊八33卜粪便中脱落细胞及FOBT对大肠癌检出敏感性未发现显著性差异O6刀9％VS 84．78％，P＞00J），但粪便中脱落细胞及FOBT两种方法对大肠癌检测特异性间存在差异显著性四8．50％VS73．68％，P＜o叫。3 脱落细胞核DNA定量分析脱落细胞核DNA含量、核面积、核异形指数、35C细胞百分率四个核定量参数在大肠癌组与非癌组间均存在差异显著性u分别功．05），癌组明显高于非癌组。DNA平均含量及35C细胞百分率与癌组织不同分化程度间存在显著性差异（P＜0．05）?

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英文缩写注释  3-5
英文摘要  5-11
中文摘要  11-16
论文正文：肠脱落细胞及其突变基因检测在大肠癌诊断中的意义  16-69
  前言  16-18
  第一部分粪大便中脱落细胞提取方法的改进  18-30
  第二部分粪便中大肠脱落细胞形态学观察、核DNA定量分析及p53蛋白表达的研究  30-53
  第三部分大肠癌患者组织及粪便中APC及K-ras基因突变的检测  53-69
总结  69-70
照片  70-87
致谢  87-88
参考文献  88-99
文献综述  99-122
  文献综述一粪便中脱落细胞及其基因检测的研究进展  99-111
  文献综述二大肠癌发病的分子机制研究进展  111-122
附录：攻读学位期间撰写的文章  122-123

大肠脱落细胞及其突变基因检测在大肠癌诊断中的意义

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