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小鼠p16～(INK4a)基因外显子1α胚胎干细胞打靶研究

作　者: 龚振明
导　师: 傅继梁
学　校: 第二军医大学
专　业: 遗传学
关键词: p16INK4a 基因打靶
分类号: Q754
类　型: 博士论文
年　份: 2001年
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内容摘要


INK4a／ARF基因位点是高等动物中迄今已知的唯一通过基因重叠编码二个 多肽的实例。外显子 1α、2、3编码 p16INK4a，外显子1β、2、3编码 p19ARF。 敲除外显子2、3的小鼠虽然能够成活和繁殖，但在生长发育早期就发生肿瘤。 敲除了外显子1β的小鼠的表型与敲除了外显子2，3的小鼠几乎完全相同。这 些结果对 p16INK4a是肿瘤抑制基因的观点提出了挑战。 如果不是 p16INK4a而是 p19ARF具有抑制肿瘤的作用，就很难解释人类30％以 上的肿瘤与p16INK4a失活有联系，而几乎从未发现外显子1β有突变的事实。敲 除外显子1α并观察p16INK4a特异性缺失小鼠的肿瘤易感性可能是探明小鼠 p16INK4a是否具有肿瘤抑制功能的最直接而有效的途径。 本研究根据已报道的小鼠p16INK4a基因第一外显子及其上游序列，用PCGEN 设计引物，以R1 ES细胞基因组DNA为模板，用PCR扩增产物作探针筛选小鼠 基因组文库，获得 14．5 Kb Sal Ⅰ／Sal Ⅰ p16INK4a基因组 DNA片段。对此片段 测序后进行生物信息学分析表明：其结构中含有与转座和同源重组有关的成 分，提示了部分肿瘤细胞中p16INK4a基因失活的可能原因。 利用筛选文库得到的DNA片段，设计并构建了针对小鼠p16INK4a基因外显 子1α的普通打靶载体和条件打靶载体。其中普通打靶载体短臂 1．5Kb，长臂 5．9Kb。条件打靶载体短臂 2．0Kb，长臂 5．9Kb，在距外显子1α起始密码上游 240bp的 Kpn2 Ⅰ切点处插入第一个loxP；在距外显子1α起始密码下游 1633bp 的 Spe Ⅰ切点处正向插入第二个 loxP。经 Cre介导后可将外显子1α和选择 标记Neo基因同时删除。 条件打靶载体线性化和电泳纯化后用于对ES细胞电穿孔，经G418和 Gancyclovir双药选择后挑选出抗药性克隆24个，获得一个经Southern杂交 鉴定的阳性克隆。

全文目录


缩写词表  4-5
  5
  5-6
  6
  6-7
前言  7-12
第一部分 小鼠p16~（INK4a）基因组DNA的克隆  12-28
第二部分 基因打靶载体的构建  28-46
第三部分 ES细胞基因打靶和阳性克隆的筛选与鉴定  46-54
研究工作小结  54-55
文献综述  55-71
  71-82
附录  82-103
致谢  103

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 分子遗传学 > 基因的结构和突变的分子原理
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