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P2X家族受体在白血病中的异常表达及异常功能研究

作　者: 种靖慧
导　师: 庞天翔；郑国光
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: P2X受体 P2X7受体儿童急性白血病单点突变恶性肿瘤
分类号: R733.7
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

核苷酸类物质是新近阐明的细胞间通讯载体,它们结合细胞膜上的P2家族嘌呤受体,调节细胞的生存和功能。根据结构的不同P2家族受体可分为P2X和P2Y两个家族,P2Y为七次跨膜的G蛋白偶联受体,而P2X家族受体是一种ATP门控的离子通道,具有两个跨膜结构域及位于胞内的氨基和羧基末端。P2X受体与配体结合后构象改变,实现通道开启、关闭和离子的通透。P2X7受体是P2X家族特殊成员之一,其羧基末端最长,与其他P2X家族受体亚型在药理学性质和形成溶胞孔方面有明显区别。它对二价阳离子有较强的选择性,在激动剂ATP或BzATP刺激时离子通道选择性地开放,对Na+、K+和Ca2+选择性通透；重复或者延长刺激,该通道形成大孔,可使荧光黄、溴化乙锭和YO-PRO等大分子通过。P2X受体广泛分布于各个组织和细胞,功能呈多样性,参与各种生理和病理过程。且越来越多的证据表明P2X受体各亚型之间的共表达共组装会形成新的功能性通道而发挥独特的功能,这需要我们更全面的研究P2X受体家族在任何一种细胞型或任何生理病理过程中的表达状态,利于更深入阐明他们所发挥的功能。P2X受体在血液系统肿瘤中的意义越来越受到关注,目前多集中于P2X7受体亚型的研究,发现P2X7受体表达异常与C-LL, AML, ALL, MDS, CML等多种白血病有关,目前还没有系统而全面的报道研究P2X受体家族在儿童急性白血病中的表达特点。P2X7的功能受多因素、多环节的调控,随着对P2X7受体研究的逐渐深入,研究者不断发现各种功能异常的P2X7受体。我们在白血病细胞系LCL-H和J6-1中发现了P2X7受体功能的异常,高表达CD39相关的ATP酶活性是LCL-H细胞P2X7受体功能异常的原因,而J6-1细胞中有其他因素影响P2X7受体的功能。我们从J6-1中克隆得到的P2X7受体基因在第559位有一个A→G有义突变,导致Asn187→Asp187(N187D),我们试图从基因水平解释该突变体功能异常的原因。根据以上的国内外研究背景及我室以往的研究结果,本文以P2X受体家族在儿童急性白血病的表达特点及J6-1细胞系来源的突变型P2X7受体(N187D)功能异常为研究重点,深入探讨P2X受体家族与白血病的关系及突变型P2X7受体功能调控的影响及其在白血病中的意义。本文主要完成了以下研究工作：1.应用real time RT-PCR、western blot和荧光测钙方法,证明了P2X1,4,5,7受体亚型在儿童急性白血病患者的骨髓单个核细胞中广泛表达,且其mRNA和蛋白表达水平均显著高于对照。其中尤为关注的是相对于初诊患者,P2X7受体显著高表达于复发患者中。线性相关分析发现P2X受体亚型之间存在显著的共表达特征,尤其是P2X4和P2X7之间的共表达。另外,经过标准化疗达到完全缓解后,除P2X1受体略有降低外P2X4,5,7受体表达水平均显著降低。提示造血相关的P2X受体与儿童急性白血病的发生、发展和治疗密切相关。2.在该突变体(N187D)序列基础上用overlap PCR方法回复突变得到野生型P2X7,构建了野生型及突变型P2X7真核表达载体,并转染不表达P2X7受体的K562细胞,RT-PCR、Western blot和免疫荧光法证实构建成功,获得了稳定表达细胞株(K562-W/K562-M);体外实验发现突变型P2X7受体对激动剂刺激敏感性降低,在常规浓度激动剂BzATP刺激下不能引发受体介导的一系列反应,而在高浓度的激动剂刺激下增加细胞凋亡率,介导钙离子内流,引起ERK磷酸化水平升高,并且该突变型P2X7受体敏感性降低与细胞表面ATPase活性无关；相对于K562-W,K562-M细胞在体外及裸鼠体内增殖能力明显增强,凋亡减少,且共聚焦显微镜下显示K562-M瘤块中有大量的CD206阳性的Ⅱ型巨噬细胞浸润和明显的血管新生,实时定量PCR方法证明K562-M瘤组织中人源和鼠源性促血管新生因子VEGF和人源的单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)表达水平升高,提示血管新生和巨噬细胞在其中发挥重要的作用。上述结果提示除了减少的细胞凋亡因素外,突变型P2X7受体N187D在体内还通过其他复杂的机制促进恶性肿瘤的发展。综上所述,本文首次系统而全面的研究了P2X受体家族在儿童急性白血病中的表达特点及其与疾病治疗的关系,首次在血液疾病中发现了P2X受体亚型之间显著的共表达特点,为深入阐明P2X受体家族介导的信号传递在白血病发生发展中的作用机制奠定了基础；首次确定了一种配体敏感性降低的新P2X7突变类型,区别于以往报道的无功能型和功能增强型P2X7突变体,该突变体功能异常与恶性肿瘤发展相关,为进一步阐明P2X7受体在肿瘤中的作用提供了新的思路和方向。

全文目录

中文摘要  4-6
英文摘要  6-9
前言  9-11
第一章 PZX家族受体在儿童急性白血病中的异常表达  11-34
  一、材料与试剂  11-16
  二、实验方法  16-22
  三、结果  22-32
  四、讨论  32-34
第二章突变型PZX7受体异常功能的研究  34-64
  一、材料和试剂  35-39
  二、实验方法  39-49
  三、实验结果  49-64
讨论  64-67
结论  67-68
论文综述  68-89
参考文献  89-104
攻读博士学位期间发表的文章  104-105
缩写词  105-107
博士学位论文的资助项目  107-108
致谢  108-109

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