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氨溴索对铜绿假单胞菌生物被膜密度感应系统的影响

作　者: 孙小敏
导　师: 余加林
学　校: 重庆医科大学
专　业: 儿科学
关键词: 氨溴索铜绿假单胞菌生长曲线早期黏附运动生物被膜密度感应系统信号分子毒力因子导管相关性肺部感染
分类号: R96
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

第一部分氨溴索对铜绿假单胞菌生长的影响【目的】研究氨溴索对铜绿假单胞生长的影响。【方法】LB中培养铜绿假单胞菌PAO1,利用比浊法检测浓度3.75 mg/mL和1.875 mg/mL的氨溴索作用后各组不同时间点菌液的光密度值A600,绘制生长曲线,比较各组细菌的生长曲线。【结果】不同浓度氨溴索干预后,铜绿假单胞菌的生长曲线与培养基对照组相比无显著差异。【结论】氨溴索对铜绿假单胞菌的生长无显著影响。第二部分氨溴索对铜绿假单胞菌运动及早期黏附的影响【目的】建立铜绿假单胞菌生物被膜(biofilm,BF)模型,研究氨溴索对铜绿假单胞菌运动及早期黏附的影响。【方法】应用不同浓度的琼脂平板接种PAO1菌株,培养后测量铜绿假单胞菌游动、丛集及颤触运动的范围。在96孔板中培养pGFPuv转化铜绿假单胞菌株PAO1菌株,不同浓度氨溴索干预后,利用荧光显微镜观察各组细菌的黏附量;利用荧光多功能酶标仪检测各组不同时间点的荧光强度,比较各组细菌的黏附率。【结果】氨溴索作用后,铜绿假单胞菌的各种运动能力均出现不同程度的下降(p<0.05)。荧光显微镜观察发现氨溴索干预组细菌的黏附量明显比培养基对照组稀疏,以高浓度为甚。氨溴索作用后细菌的黏附率亦出现不同程度下降,其中高浓度更为显著(p<0.05)。【结论】氨溴索可降低铜绿假单胞菌的运动能力和早期黏附,从而在BF形成的早期即可抑制BF的形成。第三部分氨溴索对铜绿假单胞菌生物被膜密度感应系统信号分子及相关基因的影响【目的】探讨氨溴索对铜绿假单胞菌BF密度感应( Quorum-sensing, QS )系统信号分子-酰化高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserinelactone,AHL)的影响,以及对AHL合成酶编码基因lasI和rhlI表达的影响。【方法】通过平板培养法建立培养成熟的铜绿假单胞菌体外BF模型,用扫描电镜(Scanning electron microscope,SEM)鉴定生物被膜的形成情况。不同浓度的氨溴索干预后,应用实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测其对信号分子AHL合成酶编码基因rhlI和lasI mRNA表达的影响;应用AHL感应菌株根癌土壤杆菌(WCF47)结合β-半乳糖苷酶活性的检测氨溴索对QS系统信号分子AHL表达的影响。【结果】平板法培养成熟生物被膜后,通过实时荧光定量PCR检测,氨溴索3.75 mg/mL作用组基因lasI和rhlI mRNA表达量相对于培养基对照组各基因的表达量均有显著减少,基因的相对表达量F值由1.000分别变化为3.548±0.070,1.914±0.050(p<0.05)。氨溴索1.875 mg/mL干预后具有同样趋势,但效应不如高浓度明显(P<0.05)。氨溴索和1.875 mg/mL和3.75 mg/mL作用后信号分子AHL的表达量较培养基对照组有明显减少,β-半乳糖苷酶活性从培养基对照组的761.286±13.301 Miller单位分别降低到645.428±15.197 Miller单位(p<0.05)和532.428±8.867 Miller单位(p<0.05)。【结论】氨溴索可以通过下调QS系统中信号分子AHL合成酶编码基因rhlI和lasI以及信号分子AHL的表达来抑制BF。第四部分氨溴索对铜绿假单胞菌生物被膜密度感应系统毒力因子及相关基因的影响【目的】探讨氨溴索对铜绿假单胞菌BF QS系统所调控的毒力因子编码基因以及各自对应的毒力因子表达的影响。【方法】通过平板培养法培养建立成熟的铜绿假单胞菌BF体外模型。采用不同浓度氨溴索作用后,应用实时荧光定量PCR检测其对QS系统毒力因子编码基因toxA, lasB, rhlA, aprA mRNA表达的影响。不同浓度氨溴索作用后,应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测外毒素A和弹性蛋白酶的水平;地衣酚-硫酸法检测鼠李糖脂水平;Folin-酚比色法检测碱性蛋白酶活性;利用氯仿提取等来检测绿脓菌素的水平,比较各组干预前后的检测结果。【结果】通过实时荧光定量PCR检测,氨溴索3.75 mg/mL作用后基因toxA, rhlA, lasB, aprA mRNA相对于培养基对照组的表达量均有显著减少,由1.000分别变化为3.033±0.083,2.702±0.086,2.095±0.095,2.196±0.097(p<0.05)。氨溴索3.75 mg/mL作用后毒力因子外毒素A、弹性蛋白酶、鼠李糖脂、碱性蛋白酶、绿脓菌素的表达量较培养基对照组有明显减少,分别由15.220±0.989 mg/L,81.384±5.440 ng/L , 289.725±6.719 mg/L , 300.588±6.526 U/L, 32.746±1.649 mg/L变化到3.482±0.600 mg/L, 29.755±3.843 ng/L, 101.741±3.315 mg/L, 105.375±3.432 U/L, 13.876±1.055 mg/L(p<0.05)。氨溴索1.875 mg/mL干预后具有同样趋势,但效应不如高浓度明显(P<0.05)。【结论】氨溴索可以降低铜绿假单胞菌生物被膜QS系统调控的毒力因子相关基因toxA, lasB, rhlA, aprA以及毒力因子外毒素A、弹性蛋白酶、鼠李糖脂、碱性蛋白酶、绿脓菌素的表达。第五部分氨溴索对铜绿假单胞菌生物被膜密度感应系统的体内干预作用【目的】建立大鼠导管相关性铜绿假单胞菌生物被膜感染模型,探讨氨溴索对铜绿假单胞菌生物被膜密度感应系统的体内干预作用。【方法】建立铜绿假单胞菌临床分离株BF体外模型,培养7天后得到成熟BF。将BF植入大鼠气管建立大鼠导管相关性铜绿假单胞菌生物被膜感染模型,分为BF感染组,氨溴索干预组,空白导管对照组。分别在BF导管植入后第4天和第7天用荧光定量PCR检测导管上信号分子合成编码基因lasI和rhlI,应用AHL感应菌株根癌土壤杆菌WCF47结合β-半乳糖苷酶活性的检测信号分子AHL的含量。将肺组织进行HE染色后,显微镜下观察肺组织的病理改变。按前述方法,分别检测各组大鼠肺组织匀浆中外毒素A、弹性蛋白酶、鼠李糖脂、碱性蛋白酶的含量。【结果】成功建立大鼠导管相关性铜绿假单胞菌生物被膜感染模型。氨溴索干预后4天和7天BF感染组与氨溴索干预组AHL编码基因lasI的相对表达量F值为1.000 VS 2.487±0.207 (p<0.05)和1.000 VS 3.221±0.211 (p<0.05);氨溴索干预后4天和7天基因rhlI BF感染组与氨溴索干预组的相对表达量F值为1.000 VS 1.591±0.197 (p<0.05)和1.000 VS 1.983±0.175 (p<0.05)。氨溴索作用4天和7天后信号分子AHL相对含量-----β-半乳糖苷酶活性分别由BF感染组的563.875±25.991和641.375±19.398变化为420.250±26.391和356.001±32.351 (Miller单位,p<0.05)。氨溴索干预4天和7天后,显微镜下各组肺组织的病理变化有显著差异。氨溴索干预组肺组织匀浆中各毒力因子的水平较BF感染组亦出现不同程度下降,且氨溴索作用7天组较氨溴索作用4天组上述改变均更加显著。【结论】氨溴索能够降低大鼠体内导管BF内的细菌QS系统信号分子AHL编码基因及信号分子AHL的表达。氨溴索干预后,可以减轻肺部的病理变化,同时可以降低肺组织匀浆中铜绿假单胞菌毒力因子外毒素A、弹性蛋白酶、鼠李糖脂、碱性蛋白酶及绿脓菌素的水平,减少肺组织中毒力因子的危害,减轻感染BF后的肺部损伤。

全文目录

符号说明  6-7
中文摘要  7-13
英文摘要  13-21
论文正文：氨溴索对铜绿假单胞菌生物被膜密度感应系统的影响  21-80
  前言  21-25
  第一部分氨溴索对铜绿假单胞菌生长的影响  25-29
    1 材料与方法  25-27
    2 结果  27
    3 讨论  27-29
  第二部分氨溴索对铜绿假单胞菌运动及早期黏附的影响  29-39
    1 材料与方法  29-32
    2 结果  32-34
    3 讨论  34-39
  第三部分氨溴索对铜绿假单胞菌生物被膜密度感应系统信号分子及相关基因的影响  39-54
    1 材料与方法  39-47
    2 结果  47-49
    3 讨论  49-54
  第四部分氨溴索对铜绿假单胞菌生物被膜密度感应系统毒力因子及相关基因的影响  54-67
    1 材料与方法  54-62
    2 结果  62-64
    3 讨论  64-67
  第五部分氨溴索对铜绿假单胞菌生物被膜密度感应系统的体内干预作用  67-80
    1 材料与方法  67-73
    2 结果  73-77
    3 讨论  77-80
全文总结  80-81
创新点及其意义  81-82
思考与展望  82-83
参考文献  83-91
附图  91-115
文献综述  115-123
致谢  123-124
攻读学位期间的研究成果及发表的学术论文目录  124

氨溴索对铜绿假单胞菌生物被膜密度感应系统的影响

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