学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

肠梗阻导致肠功能障碍的中西医结合实验研究Ⅱ

作　者: 于向阳
导　师: 周振理
学　校: 天津医科大学
专　业: 中西医结合临床
关键词: 可复性机械性完全性肠梗阻动物模型改良肠上皮修复瓜氨酸鸟氨酸脱羧酶杯状细胞高效液相色谱法肠自稳态菌群失调生物屏障内毒素血症细菌移位肠道机械屏障紧密连接 Claudin 实时荧光定量逆转录聚合酶链反应肠免疫屏障派伊尔淋巴结分泌型免疫球蛋白A 肠上皮内淋巴细胞固有层内淋巴细胞流式细胞术四君子汤肠上皮重建/修复脾虚症肠道免疫免疫调理
分类号: R656.7
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
下　载: 220次
引　用: 2次
阅　读: 论文下载

内容摘要

第一部分肠梗阻导致肠功能障碍中肠上皮、肠免疫屏障及微生态的时相性研究实验一家兔可复性肠梗阻造模方式及材料的改良目的：在前期实验建立的家兔机械性肠梗阻的基础上进行梗阻方式和材料的改良，使模型操作更简便、更经济、效果更稳定。方法：改用“肠管外压迫”的方式，将输液器部件改造成体外牵拉式锁扣，在末段回肠肠系膜无血管区戳孔，套住肠管，引出切口旁腹壁外。手术1～2天后由体外牵拉锁扣固定，造成该部位肠管的闭塞梗阻。解除梗阻时只需剪断锁扣后抽出装置。同时对体外水囊充注式梗阻装置、塑封钢缆圈套器等方法也进行了尝试。结果：该方法在造成梗阻的安全性、确切性等方面较原模型更优，避免了原方法所存在的腹腔感染、肠粘连、肠套叠以及肠穿孔等意外情况，并且不存在装置脱落等不稳定因素。结论：在获得更确切稳定的梗阻效果的基础上，改良后的方法创伤更小、造模周期更短，操作简单且材料经济，是较为理想的可复性机械性完全性肠梗阻模型。实验二肠梗阻对小肠上皮细胞的损害及其增殖修复能力的影响目的：观察急性机械性低位小肠梗阻对于小肠上皮损害程度以及其自身再增殖、修复能力的影响。方法：选用健康大耳白兔，随机分为正常对照组（Norm）、假手术组（Sham）、梗阻1h组（H₁）、梗阻6h组（H₆）、梗阻12h组(H₁₂)、梗阻24h组(H₂₄)、梗阻48h组(H₄₈)、梗阻72h组(H₇₂)，每组6只。分别对各组动物血清瓜氨酸水平、生化、小肠组织鸟氨酸脱羧酶活性，以及小肠上皮内杯状细胞形态、数量变化进行检测和观察。结果：肠梗阻后早期肠上皮细胞存在保护性的增殖加速过程，表现为ODC活性在梗阻后6h开始增高（p＜0．001），随着梗阻未解除，损害因素不断加重，ODC活性在梗阻24h下降，至72h甚至低于正常水平。对小肠上皮形态学观察中发现杯状细胞增多趋势，且形态发生时相性改变。以上指标在小肠不同部位发生变化的时相和程度并不一致，回肠较之空肠变化更显著。至梗阻48h-72h阶段，血清瓜氨酸水平低于正常水平（p＜0．05）。另外在对生化指标的检测中发现CK发生显著变化较早，相对其它指标较为敏感（24h vs 48h-72h）。结论：①肠梗阻发生后的早期就已经存在上皮的修复，表现为小肠组织ODC活性增高；②另外杯状细胞可能参与了小肠粘膜的修复，并且可能是上皮修复的关键细胞；③在梗阻后期随着上皮增殖活性的降低，血清瓜氨酸水平这一间接指标也随之降低，说明其对判断小肠功能障碍严重程度具有一定参考价值；④在肠梗阻发生后，CK相对其他生化指标可能对肠实质性损害更具有敏感的诊断提示意义。实验三小肠梗阻后肠腔内环境及微生态变化目的：观察急性机械性低位小肠梗阻发生后肠道内环境及微生态的改变，以了解肠梗阻发生后肠道自稳态破坏与肠屏障破坏的时相性关系。方法：选用健康大耳白兔，随机分为正常对照组（Norm）、假手术组（Sham）、梗阻1h组（H₁）、梗阻6h组（H₆）、梗阻12h组(H₁₂)、梗阻24h组(H₂₄)、梗阻48h组(H₄₈)、梗阻72h组(H₇₂)，每组6只。观察梗阻后每一时段小肠内PH、含水量及采用平板计数法了解肠杆菌科与双歧杆菌菌群数量变化。另外在不同时段进行血内毒素水平、各脏器细菌移位阳性率等进行观察。结果：结果显示肠梗阻发生后末段回肠的PH值逐渐下降，肠内容物含水量进行性增加，两者均在梗阻12h-24h阶段出现显著变化（p＜0．05，p＜0．01）。在对该部位肠杆菌科和双歧杆菌的培养发现，在梗阻12h-24h阶段二者出现比例倒置，肠杆菌科成为优势菌种。另外，对脏器组织的培养和对血浆内毒素检测发现，同样也是在12h-24h阶段二者出现显著性变化。结论：肠梗阻后肠功能障碍是对方面因素的综合结果，其中肠道自稳态的破坏为之后的细菌大量增殖、细菌和内毒素移位提供了环境基础。肠梗阻较早期的12h-24h阶段可能是肠内环境、微生态发生剧烈转变的阶段，同时也可能是细菌和内毒素移位的开始。而此时肠道机械屏障往往并没有出现广泛破坏，这更说明机械屏障、生物屏障、化学屏障的破坏都是肠功能障碍的危险因素。实验四肠梗阻对肠上皮Claudin1 mRNA表达的影响目的：了解急性肠梗阻发生后肠道上皮细胞间紧密连接破坏的时相性特点。方法：选用健康大耳白兔，随机分为正常对照组（Norm）、假手术组（Sham）、梗阻1h组（H₁）、梗阻6h组（H₆）、梗阻12h组(H₁₂)、梗阻24h组(H₂₄)、梗阻48h组(H₄₈)、梗阻72h组(H₇₂)，每组6只。利用实时荧光定量RT-PCR技术，对动物末段小肠上皮的紧密连接相关蛋白Claudin₁的mRNA表达情况进行相对定量分析。结果：本实验显示，梗阻发生后6h已经发现Claudin₁ mRNA表达已经显著减少至正常表达量的一半左右（p＜0．05），12h为18％（p＜0．01），24h为11％，48h-72h阶段表达量很低。结论：肠梗阻发生后早期（6h）已经发生机械屏障的破坏，表现为紧密连接蛋白上游基因的低表达，随着梗阻进展，这种低表达更加显著，至梗阻48h-72h阶段，这一基因的表达水平已经很低。提示这一阶段肠上皮的完整性已经完全失去，肠道机械屏障破坏严重。实验五肠梗阻家兔小肠免疫屏障功能的变化目的：利用肠梗阻模型，观察急性机械性肠梗阻的发生对肠道免疫系统的影响。方法：选用健康大耳白兔，随机分为正常对照组（Norm）、假手术组（Sham）、梗阻1h组（H₁）、梗阻6h组（H₆）、梗阻12h组(H₁₂)、梗阻24h组(H₂₄)、梗阻48h组(H₄₈)、梗阻72h组(H₇₂)，每组6只。采用流式细胞术对梗阻近端低位回肠、高位空肠两个不同部位小肠派伊尔淋巴结（PP）的CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺淋巴细胞亚群进行分析，利用HE染色切片计数上述两个不同部位IEL和LPL的百分比于梗阻不同阶段的变化。另外ELISA法检测小肠内分泌型免疫球蛋白A（S-IgA）含量。结果：本实验显示肠梗阻发生后12h-24h阶段，动物小肠的PP在数量上和总面积上均增加（p＜0．05），随着梗阻进展又逐渐减少，至梗阻72h阶段则显著低于正常水平（p＜0．01）。流式细胞术对PP淋巴细胞CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺亚群的分析结果显示，肠梗阻解除后PP内CD3+亚群为增多趋势，低位回肠Sham组为29．44±2．54％，12h增加为35．92±2．08％（p＜0．05），72h增至49．48±6．37％（p＜0．01）；CD4⁺亚群同样在12h阶段明显高于Sham组（84．68±2．80％vs 80．5 1±2．22％，p＜0．05），此后逐渐下降至72h则迅速减少显著低于Sham组（61．62±6．96％，p＜0．01）；CD8⁺亚群变化趋势与CD4⁺相反，在12h-24h阶段较Sham组下降（8．47±1．41％vs 11．52±1．04％，p＜0．05），之后逐渐增高至72h达到最高（22．97±4．83％，p＜0．05）；CD4⁺／CD8⁺比值的变化趋势为早期阶段先增高，24h阶段明显高于Sham组（12．10±2．17 vs 7．97±1．40，p＜0．01），后期逐渐下降至72h阶段则显著低于Sham组（3．35±1．03，p＜0．01）。上述几项在高位空肠中观察到的结果要明显晚于低位回肠，并且变化不剧烈。通过HE染色对IEL和LPL的百分比计数结果显示，不同部位的IEL百分比随着梗阻时间变化未发现明显差异，而LPL百分比在梗阻6h阶段明显增多，其中空肠部位的较Sham组有统计学差异（p＜0．05）。随着梗阻时间延长，两个部位的LPL百分比均呈下降趋势。肠腔内s-IgA的ELISA结果显示，梗阻发生后其肠内含量增高，24h阶段高于Sham组（p＜0．05），随后下降至72h的最低水平，与24h水平有差异，但与Sham组间未发现统计学差异。结论：①肠梗阻发生后，小肠PP数量和总面积均增加，这可能与梗阻后受到更多炎性因素刺激有关，另外其内淋巴细胞亚群也出现相应变化，CD3⁺呈不断增多趋势，CD4⁺亚群比例、CD4⁺／CD8⁺均在早期增多，而后随着梗阻进展逐渐下降。反之，CD8⁺亚群比例早期降低，后期增高，这些都预示着肠道免疫的一过性增强和之后的减弱；②通过对上皮内IEL、固有层LPL占总细胞数量百分比的统计，可以看出，IEL变化存在一定改变，但本实验尚未发现统计学的差异。而LPL百分比特点也是梗阻早期增大，后期下降，这可能是淋巴细胞归巢至固有层这一效应部位增多有关，后期随着淋巴细胞凋亡增多和其它大量炎性细胞浸润而至其比例下降；③s-IgA的量的变化进一步印证了上述现象，在早期肠腔内增多，至后期逐渐低于正常水平；④肠道免疫系统的激活是较早出现的，而且肠梗阻引发的肠免疫屏障改变可能存在部位上的差异，回肠更早、更强烈的出现免疫改变。而固有层效应部位上淋巴细胞可能这种差异并不明显，有待印证。第二部分四君子汤对肠梗阻解除后肠功能障碍的调节作用的实验研究实验六四君子汤对肠梗阻解除后小肠上皮修复的调理作用目的：利用可复性机械性完全性肠梗阻模型，观察比较肠梗阻梗阻解除后自然恢复与中药四君子汤对小肠上皮细胞增殖与修复的影响。方法：选用健康大耳白兔，随机分为假手术组（Sham）、梗阻48模型组(m₄₈)、自然恢复48h组(S₄₈)、中药治疗48h组(T₄₈)、自然恢复96h组(S₉₆)、中药治疗96h组(T₉₆)，每组6只。对动物模型梗阻解除后48h、96h时肠杯状细胞形态学、小肠组织鸟氨酸脱羧酶活性、血清瓜氨酸水平、紧密连接相关蛋白Claudin₁ mRNA表达等分别进行检测和观察。结果：本实验显示，在肠梗阻解除后小肠上皮的杯状细胞数量逐渐减少，48h后已经出现明显差异，96h基本恢复正常中药治疗组较自然恢复组差异更明显。血清瓜氨酸水平逐渐恢复至正常水平，中药组要早于自然恢复组（48h，p＜0．05），鸟氨酸脱羧酶活性明显增高，尤其是而中药治疗组明显高于自然恢复组（P＜0．05）。另外发现中药四君子汤可以上调Claudin₁ mRNA的表达，高于自然恢复组水平。结论：①中药四君子汤可以促进肠梗阻解除后肠上皮细胞的再增殖和上皮完整性的修复过程，表现为其可以加速肠上皮内杯状细胞对肠上皮的重建的完成进度；②可以提高小肠组织ODC活性，提示四君子汤能提高上皮再生能力；③而上皮再生后的结果体现为血清瓜氨酸水平的提高；④四君子汤可以上调肠上皮紧密连接相关蛋白Claudin₁的上游基因表达，促进肠上皮完整性的修复⑤通过结果说明肠梗阻解除后的肠功能障碍在辨证上存在脾胃虚的情况，邪实已祛，正气受损的实质可能应该包括肠上皮的损害，而四君子汤的作用靶点之一可能是促进肠隐窝干细胞的增殖从而达到上皮完整性的修复。实验七四君子汤对肠梗阻解除后小肠免疫的调理作用目的：利用可复性机械性完全性肠梗阻模型，观察比较肠梗阻解除后自然恢复及中药四君子汤对肠道免疫屏障的影响。方法：选用健康大耳白兔，随机分为假手术组（Sham）、梗阻48模型组(M₄₈)、自然恢复48h组(S₄₈)、中药治疗48h组(T₄₈)、自然恢复96h组(S₉₆)、中药治疗96h组(T₉₆)，每组6只。通过流式细胞术对动物模型梗阻解除后48h、96h时PP淋巴细胞亚群（CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺、CD4⁺／CD8⁺）进行分析、利用ELISA法对肠道内s-IgA含量进行检测以及通过病理切片对IEL、LPL百分比进行计数。结果：本实验显示，肠梗阻解除后中药干预的T48组、T96组较自然恢复的S48、S96组的PP淋巴细胞CD3+、CD4+、CD8+亚群及CD4+／CD8+比值具有调节作用，使之更快恢复或接近梗阻前水平；在对iIEL、LPL相对数量的观察中，四君子汤干预组的LPL更早的接近正常比例；各处理组s-IgA水平之间未发现统计学差异。结论：肠梗阻解除后小肠的免疫屏障功能紊乱并没有立即恢复，自然恢复48h后CD4+、CD4+／CD8+比值等指标并没有随之恢复，而却较M48组更趋下降，这可能提示肠功能的免疫状态并没有因肠梗阻解除而立即恢复，这可能是肠道内环境紊乱、肠道菌群失调以及肠上皮完整性的破坏不可能马上改善有关。而应用四君子汤可以明显促进小肠在梗阻解除之后存在的免疫屏障功能障碍。表现为，四君子汤干预组较自然恢复组的PP淋巴亚群更快恢复正常，并可能对肠效应部位的淋巴细胞分布或数量具有调节作用。肠梗阻解除后的脾胃功能受损的实质可能涵盖了肠上皮功能低下以及肠免疫系统的紊乱，而四君子汤健脾作用的靶点很可能包括对肠道免疫系统的调理作用。

全文目录

中文摘要  4-12
Abstract  12-25
英文缩略语表  25-27
前言  27-30
第一部分肠梗阻导致肠功能障碍中肠上皮、肠免疫屏障及微生态的时相性研究  30-111
  实验一家兔可复性肠梗阻造模方式及材料的改良  31-45
    1 材料与方法  32-36
    2 结果  36-43
    3 讨论  43-45
  实验二肠梗阻对小肠上皮细胞的损害及其增殖修复能力的影响  45-67
    1 材料与方法  45-51
    2 结果  51-62
    3 讨论  62-65
    4 小结  65-67
  实验三肠梗阻发生后肠道内环境及微生态变化  67-80
    1 材料与方法  67-71
    2 结果  71-76
    3 讨论  76-80
  实验四肠梗阻对肠上皮Claudin1 mRNA表达的影响  80-89
    1 材料与方法  80-84
    2 结果  84-87
    3 讨论  87-88
    4 小结  88-89
  实验五肠梗阻家兔小肠免疫屏障功能的变化  89-111
    1 材料与方法  89-93
    2 结果  93-106
    3 讨论  106-111
第二部分四君子汤对肠梗阻解除后肠功能障碍的调节作用的实验研究  111-141
  实验六四君子汤对肠梗阻解除后小肠上皮修复的调理作用  112-129
    1 材料与方法  112-115
    2 结果  115-118
    3 讨论  118-122
    4 小结  122-129
  实验七四君子汤对肠梗阻解除后小肠免疫的调理作用  129-141
    1 材料与方法  129-132
    2 结果  132-138
    3 讨论  138-139
    4 小结  139-141
结论  141-143
参考文献  143-153
攻读学位期间发表专著及论文情况  153-154
附录  154-168
文献综述  168-193
  综述一:肠功能障碍评价及检测的基础与临床  168-184
  综述二:健脾益中药对肠屏障的保护作用的机理  184-193
致谢  193-194
特别致谢  194

肠梗阻导致肠功能障碍的中西医结合实验研究Ⅱ

内容摘要

全文目录

相似论文