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水稻耐冷性遗传研究及低温胁迫相关基因Osdhn2的功能分析

作　者: 杨杰
导　师: 万建民
学　校: 南京农业大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 水稻 籼粳杂种 低温花粉不育 芽期耐冷 KS型脱水蛋白 功能分析
分类号: S511
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


水稻籼粳杂种具有强大的杂种优势,但籼粳杂种的低温敏感性是限制其利用的因素之一。以17个不同类型的籼、粳、爪哇型品种及其杂种为材料,通过分期播种,研究了温度变化对花粉育性的影响。结果表明,当花粉母细胞减数分裂期的日平均气温低于22-23℃时,亚种间杂种的花粉育性显著降低,不同组合花粉育性存在明显差异,而品种间杂种和常规品种的花粉育性受影响较小;当花粉母细胞减数分裂期的日平均气温低于20℃时,常规品种和品种间杂种的花粉发育也受到不同程度的影响,不同品种与组合间存在差异。花粉母细胞减数分裂期的日平均温度与花粉育性的相关性分析表明,温度与亚种间杂种花粉育性呈显著正相关。说明减数分裂期的亚种间杂种花粉育性受温度影响,温度对亚种间杂种花粉育性的影响较常规品种大.为探明籼粳杂种低温花粉不育的遗传基础,以籼稻品种3037和粳型广亲和品种02428的F2分离群体进行了低温花粉不育的遗传分析。通过推迟播种调节抽穗期后,F2群体花粉母细胞减数分裂期的日平均温度为21～23℃,调查了F2群体各单株的花粉育性。利用108对SSR引物构建了包含157个F2单株,覆盖12条染色体的分子标记连锁图谱。该连锁图的总长度为1857.8 cM,标记间平均距离为16.26 cM。采用区间作图法对F2群体花粉不育性进行QTL分析,共检测到2个低温花粉不育QTL,即qLTSPS2和qLTSPS5,分别位于第2、5染色体,其加性效应分别为0.021、0.045,显性效应分别为-0.246、-0.251,显性度分别为11.7和4.8,具有超显性效应,分别解释表型变异的15.6%、11.9%。两因素的方差分析表明这两个QTL之间不存在互作。利用强耐冷品种日本晴和不耐冷品种Kasalath及其衍生的98个（Nipponbare/Kasalath∥Nipponbare）回交重组自交家系（BILs）进行了水稻芽期耐冷性数量性状基因座的检测和遗传效应分析。25℃正常条件下水稻发芽7d,芽长5-10mm,5℃低温处理10d,之后升温至25℃,缓苗10d,调查活苗率,并以活苗率作为芽期耐冷性的表型值,分析亲本和98个BILs的芽期耐冷性表现。采用复合区间作图法,共检测到4个芽期耐冷性QTL,分别位于第3、第7和第12染色体上,命名为qSCT-3-1、qSCT-3-2、qSCT-7和qSCT-12。4个QTL的LOD值分别为3.51,3.68,2.03和3.61,可解释群体表型变异的12.11%,12.66%,6.82%和15.86%。在第3染色体检测到的qSCT-3-1与前人检测到的耐盐QTL在同一区间,qSCT-3-2与前人检测到的低温发芽QTL在同一区间。通过生物信息学的方法发现在第3染色体qSCT-3-1所在区域存在一个KS型脱水蛋白。利用RT-PCR方法,从水稻中克隆了该KS型脱水蛋白基因（Osdhn2,GenBank登录号:D26538）。对克隆的Osdhn2基因的生物信息学分析表明:其亲源关系与茄子的脱水蛋白更近,Osdhn2编码蛋白与茄子的脱水蛋白同源性达86%;而与大麦和小麦的KS型蛋白基因同源性67%。序列分析表明Osdhn2编码蛋白具有两个脱水蛋白保守的结构域,即一个富含赖氨酸片段（K片段）和一个丝氨酸片段（S片段）。进一步分离克隆了Osdhn2的基因组DNA,Osdhn2基因具有1个完整的外元,1个内元位于3’端非编码区。组织表达谱分析表明,Osdhn2在幼苗的根中低表达,在未成熟胚、幼穗、叶片、茎中都有表达,盐胁迫后根中表达增加。定量PCR表明Osdhn2在雌蕊中高表达,而在花药中低表达,开花授精后,在种子中表达迅速降低。定量PCR表明在干旱和低温胁迫处理后,其表达显著增强。利用PCR克隆了9311和Kasalath的Osdhn2基因及其上游约800bp启动子序列,对其进行了序列比较,发现9311在该区域与日本晴不存在序列差异,而Kasalath在启动子上游557bp处存在一个碱基的差异。为进一步研究该启动子组织表达特性,从日本晴克隆了1.3kb的启动子序列,构建了Osdhn2基因启动子GUS转基因表达载体,目前已获得转基因幼苗。将Osdhn2基因克隆到原核表达载体pET32a（+）系统,诱导基因表达,携带有Osdhn2的大肠杆菌在800mmol/LNaCl或700mmol/L KCl或4℃处理后其生长速度明显快于对照。这表明,携带水稻KS型脱水蛋白的大肠杆菌可以提高大肠杆菌耐低温和耐盐能力。为分析Osdhn2基因的功能,我们构建了Osdhn2基因的CaMV35S驱动的过量表达载体,并转化芽期不耐冷的籼稻品种Kasalath,转基因T1代种子经潮霉素抗性筛选和PCR鉴定后,对阳性株系芽期耐冷性鉴定,发现其芽期耐冷能力明显好于野生型,初步说明KS型脱水蛋白基因与水稻耐冷性有关;在200mM NaCl溶液中发芽和生长3周后,转基因株系耐盐能力也明显提高。为了功能互补分析,我们构建了该基因的RNA干扰载体,并以玉米Ubiquitin启动子驱动,目前已获得转基因幼苗。

全文目录


摘要  7-9
Abstract  9-12
第一章 文献综述  12-34
  1 水稻不同生育时期耐冷性遗传研究进展  12-15
    1.1 发芽期耐冷性  12-13
    1.2 芽期耐冷性  13
    1.3 幼苗期耐冷性  13
    1.4 孕穗期耐冷性  13-14
    1.5 低温对籼粳杂种育性的影响  14-15
  2 植物低温胁迫的基因表达调控  15-24
    2.1 低温胁迫信号  16-17
    2.2 转录调控  17-20
    2.3 转录后调控  20-24
  3 脱水蛋白研究进展  24-32
    3.1 脱水蛋白的结构及分类  24-26
    3.2 脱水蛋白的亚细胞定位及在细胞中的转运  26-27
    3.3 脱水蛋白基因的表达与调控  27-29
    3.4 脱水蛋白具有防冻剂活性作用  29-32
    3.5 水稻的脱水蛋白  32
  4 本研究的目的与意义  32-34
第二章 低温对亚种间杂种花粉育性的影响  34-41
  1 材料和方法  34-35
    1.1 材料  34-35
    1.2 方法  35
  2 结果与分析  35-39
    2.1 供试材料的抽穗期及温度指标  35-36
    2.2 花粉育性与温度的相关性分析  36-37
    2.3 温度对常规品种花粉育性的影响  37
    2.4 温度对品种间杂种花粉育性的影响  37-39
    2.5 温度对亚种间杂种花粉育性的影响  39
  3 讨论  39-41
第三章 水稻籼粳亚种间杂种低温花粉育性的QTL分析  41-49
  1 材料与方法  42-43
    1.1 材料  42
    1.2 低温处理及花粉育性调查  42
    1.3 SSR分子标记检测与连锁图的构建  42-43
    1.4 数据分析  43
  2 结果与分析  43-47
    2.1 亲本3037和02428以及杂种F_1在常温和低温条件下的花粉育性  43-44
    2.2 籼粳亚种间杂种"3037/02428"F_2群体低温花粉育性的次数分布  44
    2.3 分子连锁图谱的构建及概况  44
    2.4 低温花粉育性的QTL分析  44-46
    2.5 QTL的互作分析  46
    2.6 QTL等位基因间互作分析  46-47
  3 讨论  47-49
    3.1 低温花粉不育性和低温小穗不育性QTL的比较  47-48
    3.2 籼粳杂种低温花粉不育的遗传机制  48
    3.3 提高亚种间杂种结实率稳定性的途径  48-49
第四章 水稻芽期耐冷性的QTL分析  49-56
  1 材料与方法  50-51
    1.1 供试材料  50
    1.2 芽期耐冷性的表型鉴定  50
    1.3 数据分析  50-51
  2 结果与分析  51-53
    2.1 亲本及回交重组自交群体芽期耐冷性表现  51-52
    2.2 回交重组自交系群体芽期耐冷性QTL检查  52-53
  3 讨论  53-56
第五章 水稻KS型脱水蛋白基因Osdhn2克隆  56-90
  第一节 Osdhn2的克隆及其表达谱  57-73
    1 材料与方法  58-61
      1.1 材料  58-59
      1.2 总RNA提取和cDNA合成  59
      1.3 KS型脱水蛋白基因克隆和测序  59
      1.4 半定量PCR和荧光定量PCR  59-60
      1.5 启动子序列克隆及其GUS表达载体构建  60-61
    2 结果与分析  61-69
      2.1 Osdhn2的序列分析  61-63
      2.2 Osdhn2的组织表达谱分析  63-65
      2.3 Osdhn2的蛋白特性分析  65-66
      2.4 Osdhn2的启动子克隆及其GUS融合表达载体构建  66-68
      2.5 Osdhn2基因启动子调控区的序列分析  68-69
      2.6 Osdhn2基因启动子序列的籼粳差异  69
    3 讨论  69-73
  第二节 Osdhn2原核表达载体构建及其表达  73-78
    1 材料与方法  73-75
      1.1 材料  73
      1.2 方法  73-75
    2 结果与分析  75-77
      2.1 重组质粒的酶切鉴定  75
      2.2 重组质粒的诱导表达和Western blot鉴定  75-77
      2.3 低温和盐胁迫后转化菌株的生长情况  77
    3 讨论  77-78
  第三节 Osdhn2过量表达载体和RNAi表达载体构建及其转化  78-90
    1 材料与方法  78-83
      1.1 材料  78
      1.2 菌株及载体  78-79
      1.3 Osdhn2基因过量表达载体的构建  79
      1.4 Osdhn2基因RNAi表达载体的构建  79-80
      1.5 农杆菌转化与转基因水稻的获得  80-83
    2 结果与分析  83-88
      2.1 植物表达载体的构建、转化以及后代表型鉴定  83-88
      2.2 Osdhn2基因RNAi表达载体的构建  88
    3 讨论  88-90
全文结论  90-92
参考文献  92-106
附录  106-115
致谢  115-116
在读期间发表的论文  116

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 禾谷类作物 > 稻
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